人端粒酶反转录功能区基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化
苗佩宏;刘北一;郑山根;庞建新;徐江平
武警浙江总队医院药械科,嘉兴,314000;南方医科大学基础部免疫教研室,广州,510515;南方医科大学基础部药理教研室,广州,510515
Construction , Expression and purification of human telomerase reverse transcriptase in E. coli
MIAO Peihong;LIU Beiyi;ZHENG Shangen;PANG Jianxin;XU Jiangping
摘要 目的表达并纯化出包含所有功能基序的端粒酶催化亚基(hTERT)融合蛋白,为深入研究端粒酶作用机制、制备抗hTERT抗体和肽库筛选以端粒酶为靶的小分子抑制剂奠定基础.方法自行设计引物,以pLPC-hTERT为模板扩增出包括端粒酶发挥反转录功能所需的全部8个基序长为1 310 bp的基因片段,将PCR扩增的此片段克隆至带有6个连续组氨酸标签的原核表达载体pET-32a中,IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE和Western-Blot(WB)检测确定表达出端粒酶反转录酶功能区融合蛋白,以8 M尿素溶解以包涵体形式存在的目的蛋白,用金属鳌合层析柱纯化融合蛋白并对之进行复性.结果经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE和WB鉴定证实成功构建了表达质粒pET32a-hTERT,鉴定和测序结果亦证实包含全部8个基序的基因片段,凝胶电泳和WB确认表达出特异性的目的蛋白条带.结论成功构建pET32a-hTERT表达质粒,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得特异性的hTERT重组蛋白.
关键词 ：
端粒酶 ,
端粒酶反转录酶 ,
基因表达 ,
蛋白纯化
收稿日期: 1900-01-01
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2006, Vol. 17 
