三用紫外分析仪(天津天光光学仪器有限公司), DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器有限公司), 高效液相色谱仪(岛津SCL-10AVP, SPD-10AVP, CAT.NO.228-40000-38), 色谱柱(Kromasi1 5u 100A C18, 250 mm× 460 mm)、电子天平(AL204和AB135-S)。

五味子, 柏子仁, 炒枣仁, 夜交藤, 红花, 决明子, 大黄, 丹参, 当归, 川芎, 何首乌, 黄芪, 威灵仙, 火麻仁; 颜生胶囊(武警内蒙古总队医院提供); 阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究所, 编号110773-201313, SYD-14YX)。

乙醚、甲醇(天津市风船化学试剂科技有限公司)、环己烷(天津市福晨化学试剂厂)、冰乙酸(北京北化精细化学品有限责任公司)、二氯甲烷(天津市光复科技发展有限公司)、稀盐酸(天津市化学试剂三厂)、碳酸氢钠、碳酸钠(天津市永大化学试剂有限公司); 硅胶(青岛裕民源硅胶试剂厂), 羧甲基纤维素钠(沈阳化学试剂厂)。

2.1.1 薄层板的制备 取5 g硅胶G与0.5%CMC-Na的滤液按1∶ 3比例混合。研磨均匀后, 涂布于玻璃板上(10 cm× 15 cm或20 cm× 20 cm), 厚度为0.25 mm, 室温干燥后, 置烘箱中于105 ℃活化30 min, 置干燥器中, 放冷, 备用^[1]。

2.1.2 阿魏酸的提取分离方法

方法a:取当归对照药材粉末和川芎对照药材粉末各2 g, 加1%碳酸氢钠溶液50 ml, 超声处理20 min, 离心15 min, 取上清液用稀盐酸调pH至2~3, 用乙醚振摇提取2次, 每次20 ml, 合并乙醚液, 分别点样10 μ l, 展开。

方法b:取当归对照药材粉末和川芎对照药材粉末各2 g, 加5%碳酸钠溶液30 ml, 超声处理40 min, 滤液用乙醚萃取, 弃乙醚层, 用稀盐酸调pH值至1~2, 再用乙醚提取3次, 每次15 ml, 合并乙醚液, 分别点样10 μ l, 展开。

方法c:取当归对照药材粉末和川芎对照药材粉末各2 g, 加稀盐酸80 ml于500 ml烧杯中。超声处理40 min后, 离心15 min, 取上清液, 用乙醚提取2次每次20 ml, 合并乙醚液, 分别制得当归(上)川芎(上); 残渣加少量水溶解, 用稀盐酸调pH至2左右, 乙醚萃取3次(30 ml, 20 ml, 20 ml), 合并乙醚液, 分别制得当归(下)、川芎(下), 同法制备颜生胶囊供试液, 分别点样10 μ l, 展开。

方法d:取当归对照药材粉末和川芎对照药材粉末各2 g, 置于锥形瓶中, 加甲醇适量, 超声30 min, 分取甲醇液, 水浴蒸干。残渣加少量水溶解。用稀盐酸调pH至2左右, 乙醚萃取3次(30 ml, 20 ml, 20 ml)。合并萃取液, 回收乙醚, 残渣用少许甲醇溶解, 得对照药材溶液, 分别点样10μ l, 展开。

2.1.3 对照品、颜生胶囊供试液、阴性对照的制备 精密称取阿魏酸对照品5.4 mg, 置于100 ml 容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀。即得54 μ g/ml阿魏酸的对照品溶液。将颜生胶囊以及去掉含有阿魏酸的当归、川芎两味药材的阴性对照制剂, 分别按方法d制作, 得到颜生胶囊样品溶液、阴性对照溶液。

2.1.4 薄层色谱条件 照薄层色谱法试验^[2], 分别吸取阿魏酸标准品溶液、当归对照药材溶液、川芎对照药材溶液、颜生胶囊样品溶液、阴性对照溶液各10 μ l, 点于薄层板上, 将点样后的薄层板置于环己烷-二氯甲烷-冰乙酸(16∶ 16∶ 2)为展开剂的饱和层析缸内饱和1.0 h, 展开, 置365 nm紫外灯下检视。

2.1.5 提取分离方法筛选结果 图1-A中, 以方法a提取当归与川芎对照药材后, 斑点可以分开; 图1-B中, 以方法b提取后的当归、川芎对照药材与对照品阿魏酸相应位置斑点不明显; 图1-C以方法c提取的样品, 点样展开后, 发现在残渣中也有阿魏酸; 图1-D中, 以方法d提取的样品在颜生胶囊样品与当归、川芎对照药材、阿魏酸对照品相应位置, 显相同颜色的斑点。故以方法d作为样品中阿魏酸的提取分离方法。

图1

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	图1 不同提取分离方法薄层色谱图 A. 方法a; B. 方法b; C. 方法c; D. 方法d

2.2.1 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品精密称取5.03 mg, 加甲醇溶解, 超声30 min, 甲醇定容至100 ml, 摇匀, 浓度为50.3 μ g/ml, 作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取颜生胶囊10粒, 去囊壳, 混匀, 精密称取内容物2 g, 置锥形瓶中, 加甲醇50 ml, 超声处理30 min, 分取甲醇液, 水浴蒸干, 残渣加20 ml水溶解, 并用稀盐酸调pH 1~2, 置分液漏斗中, 用乙醚萃取3次(30 ml、20 ml、20 ml), 合并乙醚萃取液回收乙醚至干, 残渣用甲醇溶解定容至25 ml, 得供试品溶液。

2.2.3 色谱条件 流动相为甲醇-1%冰乙酸水溶液(30∶ 70); 等度洗脱, 保留时间20.465 min, 流速1 ml/min; 柱温25 ℃; 进样量20 μ l, 检测波长320 nm。理论塔板数按阿魏酸峰计不低于3000。

2.2.4 系统适用性实验 按颜生胶囊处方和制法, 制备缺当归和川芎阴性制剂, 精密称取2 g, 再按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。进样20 μ l测定, 结果阴性样品在阿魏酸相同位置处无色谱峰, 表明对阿魏酸测定无干扰, 结果见图2。

图2

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	图2 颜生胶囊高效液相色谱图 A. 阿魏酸对照品 B.颜生胶囊样品 C. 阴性对照液

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取对照品储备液(5.00 mg/100 ml), 分别在25 ml容量瓶中稀释成0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 μ g/μ l, 按上述色谱条件进样测定, 以峰面积积分值A为纵坐标, 对照品浓度为横坐标, 作线性回归, 得回归方程Y=131443X+451980, r=0.9995(n=3), 结果表明, 阿魏酸在0.25~1.50 μ g/μ l浓度范围内线性关系良好。

2.2.6 精密度 精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20 μ l, 分别重复进样5次, 结果见表1, 按上述色谱条件测定, 阿魏酸峰面积积分值相对标准偏差RSD分别为0.35%、0.73%, 结果表明, 精密度良好, 颜生胶囊供试品与阿魏酸对照品组比较, 无统计学差异。

表1

表1

表1 精密度试验结果 组别 峰面积积分值 RSD (%) 阿魏酸 对照品 2059799 2057967 2051794 2041411 2052083 0.35 颜生胶囊 供试品 1432888 1425482 1448862 1441177 1437977 0.73

表1 精密度试验结果

2.2.7 稳定性试验 取供试品溶液, 在0、1、2、4、6 h进样, 共进样5次, 按上述色谱条件分别测定, 结果见表2, RSD为1.6%, 表明供试品溶液在6 h内基本稳定。

表2

表2

表2 稳定性试验结果 组别 平均峰面积积分值(n=3) RSD (%) 1 2 3 4 5 供试品 1440143 1458752 1476926 1433247 1418069 1.6 标准品 2059856 2057964 2051894 2041534 2052465 0.35

表2 稳定性试验结果

2.2.8 含量测定 取供试品5粒, 分别定容至25 ml容量瓶中, 按“ 2.2.3” 条件测定, 5粒的含量分别为0.114、0.115、0.117、0.116、0.113 mg/粒, 平均含量0.115 mg/粒, RSD为1.4%。

2.2.9 加样回收率实验 取已知含量的样品1.0 g, 精密称定, 加入等量的阿魏酸对照品, 按供试品溶液制备项下的方法制备, 依法测定, 计算回收率, 结果见表3, 平均回收率为99.22%, RSD为1.4%。

表3

表3

表3 阿魏酸对照品加样回收率实验 编号 样品中 阿魏酸 含量(mg) 加入对 照品量 (mg) 实测 阿魏酸 含量(mg) 回收率 (%) 平均 回收率 (%) RSD (%) 1 0.151 0.150 0.299 99.3 2 0.154 0.150 0.301 99.0 3 0.156 0.150 0.301 98.4 99.22 1.4 4 0.150 0.150 0.296 98.7 5 0.145 0.150 0.297 100.7

表3 阿魏酸对照品加样回收率实验

颜生胶囊是由当归、川芎、红花、丹参、何首乌、黄芪、五味子、柏子仁、炒枣仁、夜交藤、决明子、大黄、威灵仙、火麻仁组成的复方制剂, 方中川芎与当归为君药, 二者均含有阿魏酸成分。2015版药典^[3]中, 川芎仅以对照药材薄层色谱作为其鉴别的方法, 当归以对照药材和阿魏酸的薄层色谱作为其鉴别方法, 同时以高效液相色谱法作为其阿魏酸定量的指标。因此, 在制定质量标准中, 选择当归、川芎对照药材和阿魏酸作为定性成分, 阿魏酸作为定量指标成分。

关于阿魏酸薄层色谱的研究较多^{[4, 5]}, 将药材用碳酸氢钠、碳酸钠提取, 酸化后萃取, 得到阿魏酸较少, 即使点样浓度很大, 在对照品色谱相应的位置上, 斑点很浅, 酸液提取也得不到大量的阿魏酸。本研究经反复试验发现, 采取方法d, 可以测到其中的阿魏酸, 且斑点清晰明亮、现象明显。此结果说明利用方法d可以有效地提取出颜生胶囊中的阿魏酸, 且此方法操作简便、稳定。

2015版药典^[3]中, 当归中阿魏酸含量测定选用的流动相系统是乙腈-0.085%磷酸(17∶ 83); 秦龙等^[6]以甲醇-0.5%冰乙酸溶液(34∶ 66)为流动相, 测定当归保肝胶囊中阿魏酸; 顾秀琰等^[7]测定当归、川芎不同配比中阿魏酸的含量测定时, 以乙腈-0.085%磷酸水溶液(17∶ 83)为流动相, 颜生胶囊中除当归、川芎外, 还包含有其他多种药材, 影响分离效果, 笔者最终选择甲醇-1%冰乙酸溶液(30∶ 70)为流动相。