早期大剂量地塞米松对挤压综合征大鼠模型心肌特异性损伤的疗效
於四军1, 严政2, 路靖1, 金德奎1, 张聪1, 刘惠亮1
1.100039 北京,武警总医院心内科
2.430536,武汉市第三医院心内科
通讯作者:刘惠亮,E-mail:lhl518@vip.sina.com

作者简介:於四军,博士,主治医师。

摘要

目的 评估早期大剂量地塞米松对挤压综合征大鼠模型心肌特异性损伤的疗效。方法 将Wistar大鼠随机分为4组。空白(Sham)组、对照(CS)组、生理盐水(NS)组和地塞米松(DEX)组,每组20只。CS组造模后不做任何处理;DEX组和NS组造模后在解压前即刻注射1 mg/kg地塞米松和等体积的生理盐水;Sham组对正常Wistar大鼠无造模及药物干预,行麻醉、取血和手术处理。各组收集不同时间点的血液和组织学样本。结果 心肌损伤观察指标:(1)血清cTnI OD值,解压后3 h各组间差别无统计学意义。6 h时3个处理组血清cTnI均较Sham组显著上升,CS组为(0.246+0.028),NS组为(0.202+0.033),DEX 组为(0.178+0.017),差异有统计学意义( P<0.01);NS组和DEX组均低于CS组,NS组和DEX组之间差异无统计学意义。12 h时3个处理组均高于Sham组,差异有统计学意义( P<0.01);各处理组间无统计学差异。24 h时CS组和NS组高于Sham组, P<0.05;DEX组与Sham组相比差异无统计学意义;(2)心肌细胞凋亡率CS组、NS组和DEX组各时间点均高于Sham组,差异有统计学意义( P<0.01)。3 h时NS组和DEX组低于CS组,差异有统计学意义( P<0.01),NS组和DEX组间差异无统计学意义12~24 h时间段,NS组和CS组差异无统计学意义,DEX显著低于NS和CS组,差异有统计学意义( P<0.01);(3) 心肌细胞HE染色 Sham组大鼠心肌组织正常。CS组中可见充血性改变,随时间加重。NS组和DEX组充血水肿均有不同程度的减轻,DEX组减轻更明显。结论 挤压综合征大鼠存在心肌细胞的特异性损伤,大剂量的地塞米松和与之等体积的生理盐水扩容均能改善这一现象,地塞米松明显优于生理盐水单纯扩容。大剂量糖皮质激素可能通过抑制全身炎性反应从而减轻挤压综合征大鼠的心肌损伤。

关键词: 挤压综合征; 大鼠; 炎性反应; 心肌特异性损伤; 地塞米松
中图分类号:R514
Effect of early stage high-dose dexamethasone on cardiac-specific injury in crush-syndrome rats
YU Sijun1, YAN Zheng2, LU Jing1, JIN Dekui1, ZHANG Cong1, LIU Huiliang1
1.Department of Cardiology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,100039 Beijing,China;
2.Department of Cardiology, Shouyi District of the 3rd Hospital of Wuhan, 430536 Wuhan, China
Abstract

Objective To evaluate the effect of the early stage high-dose dexamethasone on cardiac-specific injury in the crush-syndrome rats.Methods CS rats were divided into three groups:CS group, NS group and DEX group ( n=20 each). DEX group and NS group were intravenously administered 5mg/kg of dexamethasone and an equal volume of nomal saline respectively immediately before reperfusion while CS group received no treatment.A sham group serving as a blank control underwent the same procedures as all the three CS groups except for the compression and decompression and drug intervention.Results Myocardial specific injuries: (1) In serum cTnI OD, there were no statistically significant differences between all groups at 3 h after decompression. At 6h, the serum levels of cTnI increased in all three groups (compared with sham group), P<0.01. In NS group and DEX group were significantly lower than in CS group, and the P value was smaller than 0.05 and 0.01 respectively. There was no significant difference between DEX and NS groups. At 12 h in all three treatment groups were higher than in sham group ( P<0.01).The differences between the three treatment groups were not statistically significant. At 24 h in group CS group and NS group were significantly higher than in sham group, P<0.01 and P<0.05 respectively.There was no significant difference between DEX group and sham group. In DEX group was significantly lower than in CS group, P<0.05. There were no significant differences between NS and DEX group, NS and CS group. (2) Apoptosis rate in myocardium: the apoptosis rate in CS group, NS group and DEX group at each time point were higher than that in sham group, P<0.01. At 3 h in NS group and DEX group were lower than in CS group, P<0.05 and P<0.01, respectively. There was no differences between NS and DEX group. At 6 h in NS group and DEX group were still lower than in CS group, P<0.05 and P<0.01, respectively. In DEX group were lower than in NS group, P<0.05.At 12 h and 24 h, there was no difference between NS and CS group. In DEX group were significantly lower than in NS group, P<0.01. (3) HE staining of myocardium: in sham group was normal. In the CS group, the congestive changes were observed and aggravated along with increasing time. NS group and DEX group had different degree of congestion and edema relief, and the relief in DEX group was more obvious.Conclusions There is cardiac specific injury in CS rat model, which may be threated by high-dose dexamethasone and normal saline. High-dose dexamethasone is more effective than an equal volume of normal saline. High dose of glucocorticoid may reduce the myocardial injury in crush syndrome rats through its suppression of systemic inflammatory response.

Keyword: crush syndrome; rats; inflammation; cardiac-specific injury; dexamethasone

挤压综合征(crush syndrome, CS)是一类以创伤后循环休克及肾衰竭为特点的危重临床疾病, 在战争、交通事故、恐怖袭击及地震等灾难事件中颇为常见。文献[1, 2]报道, 地震中CS的发病率可达3%~20%, 在高楼坍塌等恐怖事件中则可高达40%。临床上对CS的认识已有百年, CS的完整病理生理学过程目前仍存在争议, 目前, 普遍认为局部受压导致的横纹肌溶解后产生的细胞内毒性物质在血流恢复灌注之后, 大量入血引起一系列全身性并发症[3]。文献[4]表明挤压综合征动物模型存在心肌特异性损伤, 其机制尚未清楚。另一项研究显示, 大剂量地塞米松通过PI3K-Akt-eNOS通道发挥抗炎作用以及降低缺血再灌注损伤, 从而显著提高了挤压综合征大鼠的早期生存率[4, 5]。但大剂量糖皮质激素对心肌特异性损伤的影响目前尚无研究报道。本研究通过观察早期大剂量地塞米松对挤压综合征大鼠模型心肌特异性损伤的影响, 初步探索心肌损伤的可能机制。

1 材料与方法
1.1 造模和分组

清洁级雄性Wistar大鼠140只, 购于军事医学科学院, 重320~380 g, 饲养于武警总医院中心实验室动物房, 保持室温(23± 3)℃, 相对湿度55%± 15%, 日光灯照射, 每12 h光暗交替。每5只大鼠饲养于1个笼中, 自由进食水。参考Isamu Murata等[6]造模方法。将大鼠称重后腹腔注射0.4 ml/100g水合氯醛麻醉, 仰卧放置于动物恒温毯, 设置恒温37 ℃。采用卡式止血带作用于大鼠双后肢, 使用弹簧测力计确保压力恒定为3 kg, 连续挤压5 h后解除压迫正常饲养。

将Wistar大鼠按照每组保证每个时间点存活5只的原则, 分为4组:空白(Sham)组(n=20), 对照(CS)组(n=47), 生理盐水(NS)组(n=42)和地塞米松(DEX)组(n=25), CS组造模后不做任何处理; DEX组和NS组分别在解压前即刻注射1 mg/kg的地塞米松和等体积的生理盐水; 假手术组无造模及药物干预, 余处理相同。4组解压后均饲养至特定时间点(解除压迫后3、6、12、24 h)处死并立即获取血样和组织样本。

1.2 药物和试剂

地塞米松磷酸钠注射液(瑞阳制药有限公司), 水合氯醛溶液(北京军区总医院), 生理盐水(辰欣制药), 凋亡试剂盒由瑞士罗氏公司(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)提供, 大鼠血清肌钙蛋白Elisa试剂盒(美国lifediagnosis公司, 2010-2-HS)。4%多聚甲醛溶液、乙醇、二甲苯、固体石蜡、苏木精染色等由武警总医院眼眶病研究所病理实验室提供。

1.3 血清cTnI的测定

分离后肢静脉取3 ml静脉血2500 r/min, 离心20 min取上清液, 分装后-80 ℃冷冻。择期使用大鼠血清肌钙蛋白Elisa试剂盒, 严格按照说明书操作, 待反应完全于酶标仪中测量其405 nm吸光度(OD)值。

1.4 组织学检查

采血完成后, 快速剪开胸部, 在心脏仍在跳动的情况下剪取心脏, 用生理盐水洗去血液, 置入4%多聚甲醛中固定48 h。横切取心尖部0.1 cm× 0.1 cm× 0.1 cm心室肌, 脱水石蜡包埋切片。分别行HE染色以及TUNEL染色[7], 观对比不同时间点各组的心肌细胞的形态学以及凋亡率情况。

1.5 统计学处理

使用SPSS 13.0统计软件进行数据分析, 计量资料采用± s表示。多组间比较采用单因素方差分析, 两两比较用LSD法; 方差不齐时使用Dunnett’ s T3法。 P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 纳入实验情况

实验共纳入大鼠140只, 其中麻醉意外死亡6只, 未存活至特定时间点54只, 最终每个时间点每组均为5只。除去麻醉意外死亡, Sham组共20只大鼠, 未存活至特定时间点0只; CS组共47只, 未存活至特定时间点27只; DEX组共25只, 未存活至特定时间点5只; NS组共42只, 未存活至特定时间点22只。每组3、6、12、24 h各入组5例大鼠。

2.2 血清cTnI结果

血清使用酶联免疫法中405 nm下的吸光度值, 与血清cTnI浓度呈正相关(表1)。解压后3 h各组间差别无统计学意义。6 h时3个处理组血清cTnI均上升, 差异有统计学意义( P< 0.01); 组间比较可见NS组和DEX组均低于CS组, P分别小于0.05和0.01, NS与DEX两组之间无统计学差异。12 h时3个处理组均高于Sham组, 差异有统计学意义( P< 0.01)。24 h时间点CS组和NS组仍高于Sham组, P分别小于0.01和0.05, DEX组则与Sham组无统计学差异; NS组和CS组、DEX组组别无统计学差异, 而DEX组血清cTnI低于CS组, 差异有统计学意义(P< 0.05)。

表1 各组挤压综合征大鼠血清cTnI吸光度(OD值)(%; \(\overline{x}\)± s)
2.3 TUNEL染色结果

见图1。心肌细胞凋亡率采用随机取80个400倍镜下视野计数阳性细胞率取平均值。CS、NS和DEX组各时间点凋亡率均高于Sham组, 差异有统计学意义(P< 0.01)。3组间3 h比较NS组和DEX组明显低于CS组, 但组间比较差异无统计学意义; 6 h时NS组和DEX组仍低于CS组, 同时DEX组低于NS组, 差异有统计学意义(P< 0.05); 12~24 h时间段, NS组和CS组差异无统计学意义, 但DEX组显著低于NS组和CS组, 差异有统计学意义(P< 0.05)。见表2

图1 不同时间点挤压综合征大鼠TUNEL染色
A.CS 12 h; B.DEX 12 h; C.Sham 6 h; D.NS 6 h棕色为阳性细胞核, 蓝色为正常细胞核(A、C× 200倍, B、D× 400倍)

表2 不同时间点挤压综合征大鼠心肌细胞凋亡率对比(%)
2.4 心肌细胞HE染色结果

见图2。Sham组大鼠心肌组织正常, 微细血管、心肌间质完好, 细胞核呈卵圆形, 位于细胞中央, 核膜完整。CS组中可见充血性改变, 肌间水肿, 少许纤维断裂, 偶可见炎性细胞浸润, 并随时间加重。NS组和DEX组充血水肿均有不同程度的减轻, DEX组减轻更明显。

图2 不同时间挤压综合征大鼠心脏组织HE染色
A.DEX 6 h; B.DEX 3 h; C.Sham 12 h; D.NS 12 h (A、C× 200倍, B、D× 400倍)

3 讨论

近年来, 挤压综合征的研究热点逐渐从肾脏损伤向多器官衰竭等肾外脏器损伤转移。多个研究相继证实挤压综合征动物模型存在心肌特异性损伤:血清中可见心肌酶上升, 同时病理及免疫组织化学染色存在心肌细胞凋亡[4, 8]。Shuiping等[5]研究显示, 大剂量地塞米松通过PI3K-Akt-eNOS通道发挥抗炎作用, 从而显著提高了挤压综合征大鼠的早期生存率。然而大剂量地塞米松对心肌细胞特异性损伤的研究至今未见报道。本研究观察了大剂量地塞米松(DEX)与单纯扩容组(NS)、对照组(CS)及空白组(sham)之间心肌特异性损伤指标的差异。结果显示, 在酶学指标上DEX从解压6 h开始即明显低于对照组, 且至24 h时间点即与正常大鼠无统计学差异, 大剂量地塞米松使得心肌酶cTnI的酶峰提前, 峰值下降。在组织病理学(HE染色), 变化更为明显, DEX组各时间点心肌细胞的水肿及炎性浸润均明显较轻。在免疫组化(TUNEL染色)指标上, 80个40倍视野的DEX组平均凋亡率均明显降低。同时本研究研究中观察到, 单纯扩容(NS组)亦能减轻心肌细胞损伤。

目前尚无研究表明, 大剂量糖皮质激素为何能够减轻CS大鼠心肌细胞特异性损伤。本研究认为, 全身炎性反应及低血容量休克是两个可能原因。炎性反应在挤压综合征病理生理中扮演着重要角色, 主要在以下三个方面:(1)挤压及其所致的缺血状态均可导致中性粒细胞趋化因子含量上升, 诱导中性粒细胞聚集产生炎性反应, 从而进一步加剧肌细胞的不稳定性; (2)解压后的再灌注过程产生大量氧自由基及活化的中性粒细胞, 活性氧通过激活转录因子NF-κ B诱导促炎细胞因子基因的表达, 而促炎因子TNF、IL-1等通过NADPH氧化酶再次诱导活性氧的生成, 从而形成正反馈[9, 10], 氧自由基再次诱导细胞溶解的同时, 大量的炎性反应介质使毛细血管扩张、通透性增高, 加剧血管的损伤以及血流进入肌肉的第三间隙, 进一步恶化低血容量状态; (3)局部的毒性物质、炎性反应因子和氧自由基等进入循环产生全身炎性反应, 导致远端脏器的损伤, 最终可致全身多器官衰竭[11]。文献[5]报道其他疾病导致的全身炎性反应综合征中也存在心肌细胞损伤。传统的糖皮质激素在药理剂量下具有强大的抗炎作用, Murata 等[4]已证实大剂量地塞米松通过PI3K-Akt-eNOS通道降低缺血再灌注损伤以及局部和全身的炎性反应等, 从而显著提高了挤压综合征动物模型中的生存率。Rie等[11]报道活性氧与挤压综合征的远端脏器衰竭相关, 抗炎作用抑制中性粒细胞的聚集活化, 同时减少了进入循环的氧自由基和炎性反应介质的含量, 降低远端脏器的损伤。本研究中大剂量地塞米松能够显著改善心肌细胞特异性损伤也是从治疗效果这个侧面证明, CS大鼠心肌特异性损伤的主要由全身炎性反应引起, 并能被强效抗菌药改善。同时本研究注意到单纯扩容的生理盐水同样能抑制心肌细胞的凋亡, 且在某些时间点地塞米松和生理盐水对凋亡指标的影响无统计学意义; 加之正常大鼠在抽取大量血液后可见心肌细胞凋亡上升, 本研究推测低血容量同样是心脏特异性损伤的原因之一。

全身炎性反应究竟如何导致CS大鼠心肌特异性损伤?本研究结合挤压综合征病理生理过程, 推测其心脏损伤的原因可能是, 挤压和再灌注期间产生的大量炎性反应介质及氧自由基通过循环到达心脏, 使心肌细胞细胞膜处于不稳定状态, 膜通透性上升, 代谢毒性物质更易进入心肌细胞; 全身炎性反应时, 机体处于应激状态, 交感系统兴奋, 能量消耗加大, 部分炎性反应介质促使冠状动脉痉挛, 冠脉血流减少, 同时全身的低血容量休克状态使心肌氧供进一步恶化, 从而产生心肌细胞的凋亡。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
[1] Pepe E, Mosesso V N, Falk J L, et al. Prehospital fluid resuscitation of the patient with major trauma[J]. Prehosp Emerg Care, 2002, 6: 81-91. [本文引用:1]
[2] Better O S. Management of shock and acute renal failure in casualties suffering from the crush syndrome[J]. Ren Fail, 1997, 19: 647-653. [本文引用:1]
[3] The INSARAG Medical Working Group. The medical management of the entrapped patient with crush syndrome[C]. Geneva: United Nations, 2011. [本文引用:1]
[4] Isamu Murata P D, Kazuya Ooi. Acute lethal crush-injured rats can be successfully rescued by a single injection of high-dose dexamethasone through a pathway involving PI3K-Akt-eNOS signaling[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2013, 75(2): 241-249. [本文引用:3]
[5] Shuiping Liu, Yangeng Yu, Bin Luo, et al. Impact of traumatic muscle crush injury as a cause of cardiomyocyte-specific injury: an experimental study[J]. Heart Lung and Circulation, 2013, 22: 284-290. [本文引用:2]
[6] Murata I, Ooi K, Sasaki H, et al. Characterization of systemic and histologicinjury after crush syndrome and intervals of reperfusion in a smallanimal model[J]. J Trauma, 2011, 70: 1453-1463. [本文引用:1]
[7] Mien Cheng Chen, Jen Ping Chang, Wan Chun Ho, et al. Expression ofspliceosome assembly factor SC-35 in TUNEL-positive atrialcardiomyocytes in mitral and tricuspid regurgitation: viability of atrial cardiomyocytes[J]. Int J Cardiol, 2011, 151: 323-327. [本文引用:1]
[8] Guo X, Wang D, Liu Z, et al. Electrocardiographic changes after injury in a rat model of combined crush injury. Am J Emerg Med[J]. 2013, 31: 1661-5. [本文引用:1]
[9] 陈媛, 周玖. 自由基-炎性反应与衰老性疾病[M]. 北京: 科学出版社, 2007: 102-120. [本文引用:1]
[10] Syed Gillani, Jue Cao, Takashi Suzuki, et al. The effect of ischemia reperfusion injury on skeletal muscleInjury[J]. Int J Care Injured, 2012, 43: 670-675. [本文引用:1]
[11] Nishikata R, Kato N, Hiraiwa K, et al. Oxidative stress may be involved in distant organ failure in tourniquet shock model mice[J]. Legal Medicine, 2014, 16: 70-75. [本文引用:2]