引用本文
张阳阳, 郭一沙, 陈孝储, 吴阳, 俞昶乐, 张莉. 优化积雪草苷非离子表面活性剂囊泡的处方和工艺[J]. 武警医学, 2016,27(6): 557-560
ZHANG Yangyang, GUO Yisha, CHEN Xiaochu, WU Yang, YU Changle, ZHANG Li. A study on optimize formulation and technique of asiaticoside non-ionic surfactant vesicles[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2016,27(6): 557-560  

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Copyright©2016, 《武警医学》编辑部
优化积雪草苷非离子表面活性剂囊泡的处方和工艺
张阳阳1,2, 郭一沙1, 陈孝储1, 吴阳1, 俞昶乐1, 张莉1
1.300309 天津,武警后勤学院生药与药剂学教研室
2.100027,武警北京总队医院药剂科
张莉,E-mail:zhli62tianjin@163.com

作者简介:张阳阳,硕士研究生。

基金资助: 武警后勤学院基础研究项目(WHJ201501)
摘要
目的

筛选积雪草苷非离子表面活性剂囊泡的最优处方和最佳制备工艺。

方法

采用薄膜蒸发法制备积雪草苷囊泡,以包封率和载药量为指标对非离子型表面活性剂的种类和用量、投药量、胆固醇用量、孵化时间、孵化温度等处方因素和工艺条件进行单因素考察,正交设计筛选处方、优化制备工艺,并对积雪草苷囊泡的最优处方和工艺进行验证。

结果

因素考察试验中,对积雪草苷囊泡包封率和载药量影响的顺序依次为:投药量>孵化温度>孵化时间。优化处方及工艺为:积雪草苷36 mg,孵化温度30 ℃,孵化时间30 min,其包封率和载药量分别为89.56%和25.26%,镜下观察成典型囊形。

结论

采用薄膜蒸发法所制备的积雪草苷囊泡呈圆形,分散性好,囊泡的包封率和载药量均较高。

关键词: 积雪草苷; 非离子表面活性剂; 囊泡; 薄膜蒸发法; 处方; 工艺
A study on optimize formulation and technique of asiaticoside non-ionic surfactant vesicles
ZHANG Yangyang1,2, GUO Yisha1, CHEN Xiaochu1, WU Yang1, YU Changle1, ZHANG Li1
1.Department of Pharmacy,Logistic University of Chinese People’s Armed Police Force,Tianjin 300162,China;
2.Department of Pharmacy, Beijing Municipal Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100027, China;
Abstract
Objective

To optimize the formulation and preparation technique of asiaticoside non-ionic surfactant vesicles.

Methods

The thin film evaporation method was used to prepare the asiaticoside niosomes, then taking encapsulation efficiency and drug loading rate as an indicator, a single factor experiment was conducted including prescription and technique factors such as the type and amount of surfactant, dosage of the drug, drug-lipid ratio, incubation time, incubation temperature, speed of the rotary evaporator and so on. The optimized asiaticoside niosomes formulation and preparation process was acquired by orthogonal method and was further verified.

Results

The results of single factor study showed that the three factors which had greater impact on encapsulation efficiency and drug loading rate were surfactants and the cholesterol ratio (m/m), incubation temperature and incubation time. The optimized asiaticoside niosomes formulation is as follows: asiaticoside dosage is 36 mg with the ratio of lipids as 4∶1, incubation temperature is 30 ℃, incubation time is 30 min.The encapsulation efficiency and drug loading rate of the asiaticoside noisome which was prepared according to the optimized formulation was 89.56% and 25.26% and with a microcosmic morphology of typical smooth vesicles.

Conclusions

The asiaticoside niosomes prepared by thin film evaporation method shows a well-rounded appearance with good dispersity and rather high encapsulation efficiency and drug loading rate.

Keyword: Asiaticoside; non-ionic surfactant; niosomes; thin film evaporation; formulation; technique

积雪草苷(Asiaticoside)是积雪草(Centella asiatica (L.) Urb)中的有效成分[1]。研究表明, 积雪草苷具有抑制成纤维细胞增殖、激活上皮细胞作用, 能有效地促进创面愈合, 防治瘢痕过度增生[2]。积雪草苷也通过直接抑制TGF-β 1的表达产生抗肾间质纤维化的作用[3]。由于瘢痕是正常组织修复过程中的产物, 实质是以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强, 因此, 临床常用积雪草苷治疗烧伤性瘢痕及与纤维化相关的疾病[4]。目前, 临床上常用积雪草苷软膏剂和积雪草苷脂质体制剂。但是, 积雪草苷水溶性和脂溶性均较差, 生物利用度低。非离子表面活性剂囊泡(non-ionic surfactant vesicles, niosomes)是由合成的非离子表面活性剂与胆固醇形成的一种单室或多室闭合型药物载体, 其结构组成与脂质体类似, 具有透皮性、靶向性、缓释性, 囊泡经皮给药能够携带药物穿透皮肤, 提高皮肤滞留量 [5, 6]。因此, 本研究以囊泡的形态、包封率及载药量为指标筛选积雪草苷囊泡的最优处方和最佳制备工艺, 希望获得一种易吸收、作用时间久、生物利用度高、不良反应小的积雪草苷新型制剂。

1 仪器与试药

BUCHI R-124型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司); LC-20AT高效液相色谱仪(岛津国际贸易上海有限公司); SPD-20A紫外可见检测器(岛津国际贸易上海有限公司); Motic Image Advanced3.2成像系统(Motic China Group CO, Ltd); GSY-Ⅱ 不锈钢电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂); SH-2(北京金北德工贸有限公司); KQ5200E型超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

积雪草苷对照品(中国药品生物检定所, 批号110892-200403, 纯度> 98%); 积雪草苷(广西昌州天然药业有限公司, 批号101020, 纯度为95%); 司盘20、司盘40、司盘60、司盘65、司盘80、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80(化学纯, 天津市化学试剂三厂); 乙腈(天津市康科德科技有限公司, 批号090824); 水为双蒸水。

2 方法与结果
2.1 溶液配制

2.1.1 表面活性剂溶液的配制 分别称取司盘20、司盘40、司盘60、司盘65、司盘80、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80, 以氯仿-乙醇(4∶ 1)为溶剂, 分别制成50 mg/ml的不同种类的表面活性剂溶液。

2.1.2 胆固醇溶液的配制 称取适量胆固醇, 以氯仿-乙醇(4∶ 1)为溶剂, 制备成50 mg/ml的胆固醇溶液。

2.2 囊泡制备

2.2.1 空白囊泡制备 量取2.0 ml表面活性剂溶液置于250 ml的圆底烧瓶中, 加入适量50 mg/ml胆固醇溶液, 于旋转蒸发仪上以70 r/min的速度减压蒸干溶剂, 真空干燥器中放置, 过夜。然后加入10 ml预热至60 ℃的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS), 保温孵化30 min, 磁力搅拌30 min, 即得非离子表面活性剂空白囊泡。

2.2.2 积雪草苷囊泡(Asi-Nio)制备 量取2.0 ml表面活性剂溶液, 置于250 ml圆底烧瓶中, 加入0.5 ml 50 mg/ml的胆固醇溶液, 于旋转蒸发仪上以70 r/min的速度减压蒸干溶剂, 真空干燥器中放置, 过夜。将处方量的积雪草苷用10 ml预热至60 ℃的pH 7.4的PBS溶解作为孵化液, 保温孵化30 min, 磁力搅拌30 min, 制备载药囊泡Asi-Nio。

2.3 Asi-Nio包封率及载药量测定

采用平衡透析方法测定。精密量取积雪草苷囊泡液5 ml, 置于透析袋内作为内相, 以25 ml pH 7.4磷酸盐缓冲液作为外相, 将内置透析袋的烧杯置于25 ℃恒温水浴震荡(130 r/min)计时。透析6 h后取外相液体, 用HPLC方法测定游离的积雪草苷浓度 Cfree[7, 8], 继而得到游离积雪草苷质量Wfree。用下式计算包封率和载药量:

包封率=(Wtotal-Wfree)/Wtotal× 100%

载药量 =(Wtotal-Wfree)/Wlipids× 100%

Wtotal为总投药量, Wfree为游离药物质量, Wlipids为囊泡混悬液中脂质的质量[3]。

2.4 单因素考察试验

2.4.1 不同种类表面活性剂与不同用量的胆固醇组合制备空白囊泡的考察 分别取2.0 ml司盘20、司盘40、司盘60、司盘65、司盘80、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80溶液置于250ml的圆底烧瓶中, 每种取四份, 分别加入0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml及2.0 ml胆固醇溶液, 按照“ 2.2.1” 项下方法制备空白囊泡, 显微镜下观察所制得囊泡的数量与形态。

镜下观察结果显示, 用司盘20制备的囊泡多且均匀, 呈半透明圆球状, 但是随胆固醇用量增多, 囊泡数略有减少; 而用司盘40、司盘60制备的囊泡, 则随胆固醇量增多而囊泡数减少, 同时镜下观察结晶依次增多; 用司盘65制备的囊泡, 随胆固醇量增多囊泡数变化较小, 但镜下观察结晶多; 用司盘80制备的囊泡较少。用吐温20制备的囊泡较少, 用吐温40、吐温60和吐温80制备时几乎观测不到有囊泡, 且有大量结晶存在(表1)。

表1 镜下观察不同种类表面活性剂(2 ml)与不同用量胆固醇合用制备的空白囊泡数量

2.4.2 不同种类表面活性剂对Asi-Nio包封率和载药量的影响 分别量取能形成囊泡的司盘20、司盘40、司盘60、司盘65、司盘80等表面活性剂溶液2.0 ml, 按照“ 2.2.2” 项下制备载药囊泡Asi-Nio, 测定包封率和载药量。结果显示, 薄膜蒸发法选用司盘类作为表面活性剂制备囊泡成囊率较高, 包封率和载药量均较高(表2)。

表2 不同司盘类表面活性剂对积雪草苷囊泡包封率和载药量的影响

2.4.3 不同投药量及不同投药方法对Asi-Nio包封率和载药量的影响 方法Ⅰ :预先制备0.3、0.9、1.8 、3.6 mg/ml的积雪草苷PBS溶液10 ml, 作为孵化液。参照“ 2.2.2” 项下方法制备载药囊泡。方法Ⅱ :分别将3 、9、18、36 mg的积雪草苷粉末溶解于司盘20与胆固醇混合脂质溶液中, 混匀后于旋转蒸发仪上以70 r/min的速度常温减压蒸干溶剂, 真空干燥器中放置, 过夜。加入10 ml预热至60 ℃的pH 7.4的PBS, 保温孵化10 min, 磁力搅拌30 min, 即得载药囊泡。包封率及载药量测定结果显示, 相同投药量下两种投药方法制备的Asi-Nio的包封率和载药量无显著性差异; 但是两种投料方法中, 积雪草苷投料增加时, 包封率及载药量均增加(表3)。

表3 不同投药量及不同投药方法对积雪草苷囊泡包封率和载药量的影响
2.5 正交设计优化Asi-Nio处方和制备工艺

为进一步优化Asi-Nio处方艺, 在预实验基础上选择投药量(A)孵化温度(B)和孵化时间(C)3个考察因素, 每个因素选择3个水平, 按照L9(34)正交实验设计表设计实验, 按“ 2.4.2” 项下方法Ⅱ 操作, 制备Asi-Nio。正交设计实验结果显示, 3个因素影响包封率和载药量程度大小顺序为:投药量> 孵化温度> 孵化时间(表4)。

表4 积雪草苷囊泡正交试验结果(n=3)

方差分析结果显示, 投药量与孵化温度对囊泡包封率和载药量影响的差异均有显著性意义(P< 0.05); 但是对囊泡载药量的影响, 仅孵化温度有影响, 差异有显著性意义(P< 0.01)。结合包封率和载药量各自最优原则, 权重分别为50%, 确定最佳条件为A3B1C2, 即积雪草苷投药量为36 mg, 孵化温度30 ℃, 孵化时间30 min(表5)。

表5 积雪草苷囊泡正交设计方差分析表
2.6 验证试验

根据正交试验优化的条件, 按照“ 2.4.3方法Ⅱ ” 项下操作, 制备Asi-Nio, 以包封率和载药量为评价指标对各个处方进行评定。按照“ 2.3” 方法测定囊泡的包封率和载药量。则按照最佳条件制备的积雪草苷囊泡平均包封率为89.56%± 0.013%, 平均载药量为25.26%± 0.004%(n=3)。所制备的囊泡的圆整, 粒径分布比较均匀(图1), 粒径范围(0.514± 0.043)μ m。

图1 积雪草苷囊泡(× 400)

3 讨论
3.1 积雪草苷囊泡制备

特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fibro-sis, IPF) 是病因未明的慢性进展性纤维化型间质性肺炎的一种特殊类型, 疾病进展表现为呼吸系统症状加重、肺功能恶化, 高分辨率 CT表现为进展性纤维化, 急性呼吸功能衰竭或者死亡。近年来, 由于空气中颗粒密集, 导致肺纤维化人群增多[9]。

肾间质纤维化是所有慢性肾脏病进入终末期的共同病理特征。转化生长因子β (transforming growth factor β , TGF-β )、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管紧张素 Ⅱ (Ang Ⅱ )、肝细胞因子(hepatocyte growth factor, HGF)等参与调节肾小管间质纤维化, 其中TGF-β 通过SMAD 受体促进肾小管上皮细胞-肌成纤维 细 胞 转 分 化被认为是促进肾小管间质纤维化最重要的途径之一[10]。因此, 改善或延缓肾小管间质纤维化、肺纤维化以及肝纤维化的药物仍然较少, 且治疗效果欠佳, 故进一步探索纤维化的治疗药物及剂型具有重要意义。

文献[10]报道, 积雪草苷具有抗肾脏、肝脏和肺纤维化的作用, 并能够抑制瘢痕增生, 是一个非常理想的抗纤维化药物。但是由于其水溶性较差, 限制了积雪草苷的应用。制备适宜的具有靶向性和缓释作用的剂型, 可能会提高积雪草苷的治疗效果, 因此, 本研究制备了稳定性较好的非离子表面活性剂囊泡。

非离子表面活性剂囊泡是采用各种非离子表面活性剂为囊材, 通过自身封闭形成的双层闭合体系微型或多室囊泡状载体, 将药物包裹进非离子表面活性剂囊泡内, 可减少药物在达到有效部位前被破坏、延长药物半衰期、从而延长药物的作用时间及降低毒副作用[11], 改变药物在体内的分布过程, 达到被动靶向作用等, 通过加入适当特殊辅料修饰后也可达到主动靶向和物理化学靶向的作用[12, 13]。胆固醇可改变囊泡的物理性质、改善囊泡的膜流动性, 对其形态与结构具有稳定作用, 是囊泡的重要组成部分之一[14]。

3.2 囊材选择

本研究中不同表面活性剂对积雪草苷囊泡包封率和载药量的影响结果显示, 在镜下观察中发现, 以吐温类和胆固醇为膜材制备生成的囊泡数变化较大, 且有大量结晶存在。在司盘类表面活性剂中, 由于用司盘20制备的囊泡镜下观察生成囊泡较多, 且包封率和载药量分别为62.57%和1.50%, 因此, 选用司盘20为膜材制备积雪草苷囊泡。

3.3 药物加入方法考察

采用有机溶剂将药物溶解后加入混合脂质溶液中, 然后旋转蒸发去除有机溶剂, 此方法获得载药囊泡的包封率和载药量均高, 分析原因可能是药物与混合脂质均匀混合, 在溶剂蒸发后形成高分散度的固体分散体系所致。

3.4 薄膜分散法制备工艺考察

用薄膜分散法制备非离子表面活性剂囊泡, 囊泡大小和形状的关键因素在于膜的形成, 因而本研究曾分别量取2 ml表面活性剂溶液和0.5 ml胆固醇溶液混合后置于100、250、500 的圆底烧瓶中, 于旋转蒸发仪上以70 r/min的速度减压常温蒸干溶剂, 观察成膜的均匀性和透明性。通过对比100、250、500 ml的圆底烧瓶对成膜的影响发现, 将表面活性剂与胆固醇溶液置于250 ml的圆底烧瓶中形成的薄膜较为均匀、透明。

The authors have declared that no competing interests exist.

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