引用本文
徐劲, 乔丽, 杨志勇, 刘玮. Caspase-3对5-ALA诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡效应的影响[J]. 武警医学, 2017,28(3): 232-234
XU Jin, QIAO Li, YANG Zhiyong, LIU Wei. Effects of caspase 3 on apoptosis of squamous-cell carcinoma Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2017,28(3): 232-234  

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Caspase-3对5-ALA诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡效应的影响
徐劲, 乔丽, 杨志勇, 刘玮
100142 北京,空军总医院皮肤科
通讯作者：乔 丽,E-mail:winhp2006@163.com

作者简介:徐 劲, 硕士,主治医师。

收稿日期: 2016-12-10
摘要

目的 探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)对光敏剂5-氨基酮戊酸(5-ALA)诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡效应的影响。方法 取对数生长期的Colo-16细胞用于实验,将细胞分为对照组、5-ALA-光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)组和Caspase-3抑制剂组(Z-DEVD-FMK),对照组不给予光敏剂和照光处理,5-ALA-PDT组给予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后,采用(功率密度10 mW/cm2,能量密度2.5 J/cm2)激光照射3 min,之后继续培养12 h。Caspase-3抑制剂组除孵育时同时加入Z-DEVD-FMK(终浓度40 μmol),其余处理与5-ALA-PDT组相同。实验后收集各组细胞,通过免疫荧光观察各组细胞胞内Caspase-3荧光强度的变化,通过流式细胞术检测活性Caspase-3阳性细胞百分率和细胞凋亡率。结果 免疫荧光结果发现对照组和Caspase-3抑制剂组Colo-16细胞胞浆中有微弱绿色荧光,表明Caspase-3表达量低,而5-ALA-PDT组中绿色荧光显著增强,表明其胞浆内Caspase-3含量显著增高。流式细胞仪的检测结果显示,对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组active-Caspase-3阳性细胞百分率分别为(2.26±0.16)%、(32.16±1.31)%和(3.36±0.31)%,5-ALA-PDT组高于对照组和Caspase-3抑制剂组,差异有统计学差异( P<0.05)。对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组的凋亡率分别为(2.35±0.22)%、(31.55±3.68)%和(11.46±2.25)%,三组之间两两比较,差异都有统计学意义( P<0.01)。结论 5-ALA-PDT可以诱导Colo-16细胞发生凋亡,且这种效应与caspase-3的激活密切相关。

关键词: 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3; 鳞状细胞癌; Colo-16细胞; 5-氨基酮戊酸; 细胞凋亡
中图分类号:R739.5; R730.57
Effects of caspase 3 on apoptosis of squamous-cell carcinoma Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT
XU Jin, QIAO Li, YANG Zhiyong, LIU Wei
Department of Dermatology, General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China
Abstract

Objective To investigate the role of caspase-3 in the apoptosis of squamous-cell carcinoma Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT.Methods Colo-16 cells in the logarithmic growth phase were divided into three groups: control group, 5-ALA photodynamic therapy (PDT) group, and caspase-3 inhibitor group (Z-DEVD-FMK). Control group was not given photosensitizer or light treatment. 5-ALA PDT group was exposed to 3-minute laser irradiation at a power density of 10 mW/cm2 and energy density of 2.5 J/cm2 after 4 hours of dark incubation with 0.4 mg/ml 5-ALA before being cultured for 12 hours. Caspase3 inhibitor group was treated in the same way as 5-ALA PDT group except that Z-DEVD-FMK at a final concentration of 40 μmol was added during incubation. Cells in each group were collected after experiment, the changes of intracellular caspase-3 fluorescence intensity were observed by immunofluorescence, and the percentage of positive cells and apoptosis rate of active caspase-3 were detected by flow cytometry.Results Immunofluorescence results showed that there was weak green fluorescence in the cytoplasm of Colo-16 cells in control group and Caspase-3 inhibitor group, indicating a low expression of caspase-3, while green fluorescence was significantly enhanced in 5-ALA-PDT group, showing a significant increase of caspase-3 content in cytoplasm of Colo-16 cells. Flow cytometry results showed that the respective percentage of active caspase-3 positive cells was (2.26±0.16)%,(32.16±1.31)% and (3.36±0.31)% in control group, 5-ALA PDT group and caspase-3 inhibitor group respectively. The difference was statistically significant ( P<0.05). The apoptosis rate of control group, 5-ALA PDT group and caspase-3 inhibitor group was (2.35±0.22)%,(31.55±3.68)% and (11.46±2.25)%, respectively. Paired comparison was made between the three groups, and the differences were statistically significant ( P<0.01).Conclusions The apoptosis of Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT is closely related to the activation of caspase-3.

Keyword: caspase-3; human cutaneous carcinoma cell line; Colo-16; 5-ALA-PDT; apoptosis

光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是一种治疗肿瘤的新方法, 在多种恶性肿瘤的临床实验研究中取得了满意的疗效[1]。目前研究表明, PDT诱导肿瘤细胞凋亡是其发挥抗肿瘤疗效的重要机制之一。细胞中主要存在两条凋亡信号转导通路, 即死亡受体通路和线粒体通路, 而这两条通路激活后最终均需要经过Caspase-3来执行凋亡效应, 因此Caspase-3是凋亡通路中的关键效应蛋白[2, 3, 4, 5, 6]。基于上述研究进展, 本研究假设Colo-16细胞在经过5-ALA-PDT照射后可导致Caspase-3的活化从而引起肿瘤细胞凋亡, 进一步探讨5-ALA-PDT 诱导Colo-16细胞凋亡的分子机制打下基础, 并为临床5-ALA-PDT治疗皮肤鳞状细胞癌提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 细胞株、主要试剂和仪器

Colo-16细胞, 南京皮肤病研究所惠赠。主要试剂5-ALA(购于Sigma公司); Caspase-3mAb (美国RD公司); DMEM高糖培养液(美国Gibco公司); 胎牛血清(美国Gibco公司); 细胞周期试剂盒(美国BD公司); 630 nm半导体红光激光器(桂林兴达光电医疗器械有限公司); LM-93II型激光功率计(中国电子计量院); Olympus-BH2型生物显微镜(日本Olympus公司); 流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞的培养及传代

细胞培养:Colo-16细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养液, 温度37 ℃, 5%CO2条件下培养, 取对数生长期细胞用于实验。细胞传代:待细胞80%~90%融合时, 用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液。按1: 2比例传代培养。

1.3 实验分组与处理

实验分为对照组、5-ALA-PDT组和 Caspase-3抑制剂组。对照组不给予光敏剂和照光处理, 5-ALA-PDT组给予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后, 用激光照射3 min(功率密度10 mW/cm2, 能量密度2.5 J/cm2), 照光前后均监测输出功率, 输出功率波动范围± 5%, 之后继续培养12 h。Caspase-3抑制剂组除孵育时同时加入Z-DEVD-FMK(终浓度40 μ mol), 其余处理与5-ALA-PDT组相同。实验处理后收集细胞, 进行下一步的检测, 每组实验重复5次。

1.4 Caspase-3荧光染色及观察

将灭菌后的盖玻片经多聚赖氨酸包被后置于6孔板中, 加入一定量的细胞悬液, 培养过夜待细胞完全贴壁后进行实验。实验后倾去培养液并用PBS洗涤, 依次用4%浓度的多聚甲醛中处理20 min, 用0.1% Triton x-100将细胞固定6 min。之后用PBS洗涤, 并加入适量的Caspase-3单克隆抗体(santa Cat# sc-271759; 1: 100稀释)4 ℃孵育24 h。再用PBS洗涤并加入FITC-缀合山羊抗鼠免疫球蛋白(中杉金桥 ZF-0312; 1: 1000稀释)室温孵育40 min。加入PI(150 mmol/L)并在荧光显微镜下观察Caspase-3的荧光强度。

1.5 流式细胞技术检测active-Caspase-3的表达

染色方法和检测方法参照试剂盒的说明书进行。收集各组细胞, 离心后用PBS洗涤各组细胞2次, 再次离心后用Binding Buffer制成总数为1× 105细胞/毫升的重悬液。用Cytofix/CytopermTM(BD公司, 美国)破细胞膜后加入Caspase-3 mAb(1: 50), 室温下避光孵育2 h; 用PBS洗涤3次后加入用FITC标记的二抗(1: 100), 室温避光孵育30 min, 流式细胞仪检测分析。每标本计数105个细胞, 每组实验重复5次。FITC的EM波长为525 nm, EX波长为488 nm。

1.6 PI染色法检测Colo-16细胞的凋亡率

染色及检测方法按照试剂盒的说明书进行。分别收集各组细胞, 经胰酶消化后用PBS制成单细胞悬液, 乙醇4 ℃固定过夜。上机检测前用PBS洗去乙醇后离心, 再用PBS(RNaseA 0.1 μ g/ml和PI 40 μ g/ml)重新悬浮细胞, 37 ℃避光孵育15 min, 最后经流式细胞仪检测及分析。每组实验重复5次。PI的EM为633 nm, EX波长为488 nm。

1.7 统计学处理

采用 SPSS 17.0软件包进行统计学处理, 计量资料以 x̅± s来表示, 组间均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用多重比较, P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 5-ALA-PDT诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡中Caspase-3表达的变化

经FITC-Caspase-3和PI染色后在荧光显微镜下观察到, 各组Colo-16细胞爬片上都有散在的细胞核结构, 核大圆形或椭圆形, 染色呈红色。对照组可以观察到双核细胞, 表明该组细胞仍然处于分裂增殖阶段。对照组和Caspase-3抑制剂组Colo-16细胞的细胞浆中有微弱绿色荧光, 表明Caspase-3表达量低, 5-ALA-PDT组中绿色荧光显著增强, 表明其胞浆内Caspase-3含量增高(图1)。流式细胞仪的检测结果显示, 对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组active-Caspase-3阳性细胞百分率分别是(2.26± 0.16)%、(32.16± 1.31)%和(3.36± 0.31)%, 5-ALA-PDT组高于对照组和Caspase-3抑制剂组, 差异有统计学意义(P< 0.05)。

2.2 抑制 Caspase-3活化对5-ALA诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡的影响

对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组的凋亡率分别为(2.35± 0.22)%、(31.55± 3.68)%和(11.46± 2.25)%, 3组之间两两比较, 差异均有统计学意义(P< 0.01)。

图1 免疫荧光观察5-ALA-PDT 处理后胞浆中Caspase-3的表达情
A.对照组; B. 5-ALA-PDT组; C. Caspase-3抑制剂组

3 讨 论

随着激光系统和光敏剂的不断发展, 光动力日益成为治疗肿瘤的新方法, 被广泛应用于临床中。光动力已经被用于皮肤鳞状细胞癌的治疗性和姑息性处理, 也常应用于一些较大区域而且浅层或有多种肿瘤同时存在的皮肤癌的治疗。PDT处理后的病变区域外观好, 不遗留瘢痕, 避免了外科手术瘢痕给患者造成的精神痛苦。光动力导致肿瘤细胞的凋亡主要体现在3个方面:(1)肿瘤细胞的直接杀伤作用; (2)通过作用于肿瘤组织的微血管造成血管完全封闭, 使肿瘤组织缺氧, 从而导致肿瘤组织坏死; (3)调节免疫的作用。肿瘤细胞经过PDT作用后主要以凋亡或坏死为主。光动力能引起细胞以凋亡、坏死和自噬三种不同形式死亡, 其对肿瘤的治疗作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡而产生的[4, 7]。Caspase-3起执行细胞凋亡、剪切凋亡底物作用, 是最重要的凋亡执行因子。因此, 探索Caspase-3在光动力治疗肿瘤中的变化规律及其生物学作用具有重要作用。

本研究结果表明, PDT治疗后Colo-16细胞凋亡率显著上升, 同时胞内Caspase-3的表达量也显著上升。而采用Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK后可显著抑制PDT诱导的胞内Caspase-3的表达, 并缓解PDT治疗诱导的细胞凋亡。此外, 尽管Z-DEVD-FMK可以特异性抑制Caspase-3的活性, 但该组细胞经5-ALA-PDT作用后凋亡率仍明显高于对照组, 表明5-ALA-PDT诱导COLO-16细胞发生凋亡效应并不仅仅依赖于Caspase-3的激活, 可能还与信号传导途径的激活或其他因子的释放有关。由于PDT诱导肿瘤细胞凋亡是一个多因素参与的复杂反应体系[8, 9, 10, 11], 还需要进一步研究和完善凋亡的各种机制。

综上所述, 本研究检测了在5-ALA-PDT诱导COLO-16细胞发生死亡效应时Caspase-3的表达及活化情况, 并探讨了其与COLO-16细胞凋亡的关系。结果表明在5-ALA-PDT治疗后, COLO-16细胞中活化的caspase-3显著增加, 从而导致了肿瘤细胞的凋亡。下一步, 还将深入研究5-ALA-PDT诱导的肿瘤细胞凋亡的机制, 从而为临床上广泛应用5-ALA-PDT治疗皮肤鳞状细胞癌提供了理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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