引用本文
袁洁, 张军, 戴金颖, 王顺意, 徐雪梅, 赵静, 刘颖. 益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰腺miR-375表达水平和胰岛功能的影响[J]. 武警医学, 2017,28(4): 347-351
YUAN Jie, ZHANG Jun, DAI Jinying, WANG Shunyi, XU Xuemei, ZHAO Jing, LIU Ying. Effects of Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction on miR-375 in pancreatic tissue and on functions of β cells in diabetic rat models[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2017,28(4): 347-351  

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益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰腺miR-375表达水平和胰岛功能的影响
袁洁1, 张军2, 戴金颖1, 王顺意1, 徐雪梅1, 赵静1, 刘颖2
1.063000 唐山,华北理工大学
2.063000,唐山市中医医院内分泌一科
通讯作者:张 军,E-mail:tszhangj@126.com

作者简介:袁 洁,硕士。

收稿日期: 2016-08-29
基金资助: 河北省中医药管理局2015年度中医药类科研计划课题(2015049)
摘要

目的 探讨益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰腺组织中miR-375表达水平的影响,并分析其与胰岛β细胞功能的相关性。方法 采用小剂量链脲佐菌素(STZ)加高脂饮食诱导2型糖尿病大鼠模型。设空白组、模型组、益气养阴活血方(自拟) 高、中、低剂量治疗组,于治疗8周后处死大鼠。分别测定大鼠体质量、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2hBG)、胰岛素敏感指数(ISI)并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),胰岛素分泌指数(HOMA-β)光镜下观察胰岛形态学变化,通过实时荧光定量PCR技术检测胰腺组织中miR-375的表达水平。结果 经益气养阴活血方治疗后,大鼠的体质量、FBG、2hBG均不同程度降低( P<0.05);HOMA-IR均有所降低,ISI HOMA-β均有所升高( P<0.05);胰岛细胞形态有不同程度改善;胰腺组织中的 miR-375 表达量显著降低,模型组(2.29±0.91),益气养阴活血方低剂量组(0.33±0.21),中剂量组(0.43±0.32),高剂量组(0.48±0.19),治疗前后比较差异有统计学意义( P<0.05)。结论 益气养阴活血方可改善胰岛β细胞功能。其改善的原因可能与胰腺中miR-375表达下调有关。

关键词: 益气养阴活血方; 2型糖尿病大鼠; miR-375; 胰岛β细胞功能;
中图分类号:R285.5
Effects of Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction on miR-375 in pancreatic tissue and on functions of β cells in diabetic rat models
YUAN Jie1, ZHANG Jun2, DAI Jinying1, WANG Shunyi1, XU Xuemei1, ZHAO Jing1, LIU Ying2
1.North China University of Science and Technology, Tangshan, 063000, China
2.Department of Endocrinology, Tangshan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Tangshan 063000, China
Abstract

Objective To study the effect of Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction on miR-375 in pancreatic tissue and on the function of β cells in diabetic rat models.Methods Diabetic rat models were established using high-energy diet and intravenous injection of streptozocin(STZ).The rats were divided into blank group,model group,and high-,medium- and low-dose Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction groups. After 8 weeks of administration,body weight ( BW) was measured and blood was collected for detection of fasting blood glucose (FBG),fasting blood insulin(FINS),insulin sensitive index(ISI) and for calculation of the indexes of insulin resistance(HOMA-IR). Before the rats were sacrificed,2-hour plasma glucose(2hPG) was determined. The histopathological features in the islet tissue were examined with HE staining. The level of miR-375 in the islet tissue was detected with qPCR. Single factor analysis of variance was used to sort out the data.Results After the treatment with Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction, the levels of WB,FBG,2hPG,FINS and HOMA-IR decreased significantly ( P<0.05) compared with the model group while the ISI was increased significantly( P<0.05).The islet apoptosis was reduced by the administration of this decoction.Compared with model group (2.29±0.91),the levels of miR-375 in the high dose Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction group(0.48±0.19),medium dose group(0.43±0.32)and low dose group(0.33±0.21)were decreased significantly( P<0.05).Conclusions Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction can improve islet beta cell function,and the mechanism may be associated with the down-regulation of the level of miR-375 in islet tissues.

Keyword: Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction; T2DM model; miR-375; islet beta cell function

糖尿病多属于中医“ 消渴病” 的范畴, 由于其起病隐匿且病程漫长, 在糖耐量受损阶段及糖尿病早期, 因无明显的“ 三多一少” 的临床症状, 往往被人们忽略, 来医院就诊时往往发病已久。中医自古就有“ 久病多虚、久病多瘀” 之说, 因此糖尿病患者中医辨证多有气阴两虚兼有瘀血阻络之征象。据报道, 此类证型的发生率为60%左右[1]。基于此, 结合临床实践, 自拟益气养阴活血方(由太子参、黄芪、黄精、当归、山萸肉、鬼箭羽、丹参、三七粉组成)治疗消渴病辩证属气阴两虚兼瘀者, 取得了良好的治疗效果。本研究旨在通过测定2型糖尿病大鼠胰腺中miR-375 的表达以及ISI、HOMA-IR等指标, 并观察光镜下胰岛细胞的变化, 探讨不同剂量益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰岛β 细胞的保护作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法
1.1 动物分组及处理

选取SPF级5周龄雄性SD大鼠50只, 体质量( 240.0± 4.1)g, 由解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供, 动物许可证号:SCXK-(军)-2014-0001。将其饲养于华北理工大学动物实验中心清洁级动物房。适应性喂养1周后, 随机分组, 空白组10只常规喂养, 其余40只大鼠喂以高脂饲料( 每克饲料含58%脂肪, 25.6%糖类, 16.4%蛋白质, 北京华阜康生物科技股份有限公司) 。饲养4周后, 除空白组外其余给予大鼠腹腔注射35 mg/kg STZ(pH 4.4)溶液。72 h后, 测空腹血糖高于11.1 mmol/L 的SD大鼠入组, 随机分组, 每组10只。模型组10只, 给予等体积生理盐水; 低剂量益气养阴活血方组(低剂量组)10只, 给予1.2 ml/(100 g· d), 中剂量益气养阴活血方组(中剂量组)10只, 给予1.6 ml/(100g· d), 高剂量益气养阴活血方组(高剂量组)10只, 给予 2.0 ml/(100 g· d)。由于造模和灌胃过程中的损耗, 最终各组SD大鼠只数为:空白组10只, 模型组9只, 低剂量益气养阴活血方组9只, 中剂量益气养阴活血方组9只, 高剂量益气养阴活血方组8只。

1.2 相关指标测定

于开始灌胃当天, 喂药后2、4、6、8 周测量大鼠体质量、空腹血糖、餐后2 hPG。末次给药后腹主动脉取血, 分离血清, 放于-20 ℃冰箱中保存, 用于大鼠生化指标检测; 于胰尾处取小块组织, 以备HE染色。切取胰腺部分组织置于EP管中, 在-80 ℃低温冰箱冻存, 用于miRNA-375表达水平的检测。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immune-sorbent assay, ELISA)检测试剂盒检测各组大鼠血清中FINS的含量, 按试剂盒说明书操作步骤严格操作。计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR, HOMA-IR=FBG× FINS/22.5[2], 胰岛素敏感指数ISI, 计算公式 ISI=In(1/FPG× FINS)[3], 其中 FINS 单位为μ g/L, FBG单位为 mmol/L。胰岛素分泌指数HOMA-β =20× FINS/(FBG-3.5)。

1.3 实时荧光定量PCR检测miR-375表达

1.3.1 胰腺总RNA的提取 采用Trizol(美国Ambion公司)法提取大鼠胰腺组织总RNA, 紫外吸收测定法对RNA含量进行鉴定, 置-80 ℃冰箱保存备用。准备miRNA-375和U6引物:均设计合成于上海生工有限公司。引物序列设计如表1。

表1 胰腺总RNA提取的引物序列设计

1.3.2 反转录成cDNA 以RNA为模板, 使用M-MLV反转录酶进行第一链cDNA的合成, 构建20 μ l的反应体系:茎环引物1 μ l, 样品RNA 2 μ g (1/浓度× 1000 μ l), 10 mMDNTP 1μ l, 加DEPC水至10 μ l。混合物在65 ℃加热5 min后, 迅速置于冰上冷却1 min, 短暂离心后加入以下组织:5× 第一链合成缓冲液4 μ l, 0.1MDTT 2 μ l, RNaseOUTTM核酸酶抑制剂 1 μ l, M-MLV反转录酶1 μ l, DEPC水2 μ l。在离心管中轻轻将各种成分混合, 吹打均匀, 上机进行反转录, 反转录反应时间设置为:37 ℃反应52 min、72 ℃反应15 min、4 ℃终止反应, 以此程序合成cDNA第一链, 标记后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 PCR扩增反应 建立20μ l PCR扩增反应液体系如表2。

表2 PCR扩增反应体系

加样后短暂离心至无气泡后放入PCR仪进行扩增实验, 其反应体系条件为:95 ℃预变性10 min一个循环, 95 ℃变性15 s, 61 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40个循环。所有试验项目均在华北理工大学基础医学院、河北省慢性疾病重点实验室、唐山市慢性病临床基础研究重点实验室完成。

1.4 统计学处理

所得实验数据应用SPSS 19.0统计学软件进行处理与分析, 计量资料以 x̅± s表示, 多样本均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较方差齐采用LSD法, 方差不齐采用Dunnetts T3法; 两样本组间及组内均数比较采用t检验(P< 0.05), 为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 一般状态及体质量的变化

2.1.1 一般情况 2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠造模成功后, 与空白组比较, 模型大鼠毛发干枯发黄, 体质量显著增加, 活动力减弱, 反应迟缓, 进食量、饮水量及尿量均明显增加, 对外界刺激反应不灵敏。各治疗组较模型组大鼠状态良好。

2.1.2 实验0、2、4、6、8周体质量变化 各组大鼠用药前后体质量比较结果显示:0周时, 与空白组比较, 模型组与各治疗组大鼠体质量显著升高(P< 0.05), 而模型组与各治疗组比较无差异; 组内比较, 用药2周开始益气养阴活血方各剂量组体质量均不同程度减轻(P< 0.05); 用药8周后各组大鼠与模型组比较, 益气养阴活血方低、中、高剂量组均有显著降低(P< 0.05), 且3组间比较无统计学意义(P> 0.05, 图1)。

图1 大鼠0、2、4、6、8周体质量变化

2.2 用药前后FBG、2hBG比较

用药前各组大鼠比较, 模型组及益气养阴活血方各剂量组的FBG、2hPG未见明显差异, 但与空白组比较均有明显升高(P< 0.05); 用药后各组大鼠与模型组比较, 益气养阴活血方各剂量组FBG、2hPG均有不同程度的降低(P< 0.05), 其中益气养阴活血方中剂量组降低2hPG效果最为明显, 优于其他两组(P< 0.05)。组内比较, 用药后益气养阴活血方各剂量组较用药前FBG和2hPG均可不同程度的降低, 差异有统计学意义(P< 0.05, 表3)。

表3 2型糖尿病大鼠各组FBG及2 hBG的比较( x̅± s; mmol/L)
2.3 胰岛形态学改变

由胰腺HE染色图片可以观察到, 正常大鼠的胰岛多为圆形或椭圆形的细胞团, 边缘平滑界线鲜明, 分散于胰腺腺泡之间, β 细胞分布均匀, 形态规则(图2A)。模型组大鼠胰岛萎缩、细胞破裂、排列紊乱, 胰岛边缘β 细胞出现聚集, 细胞大小不均匀, 胰腺呈分叶状, 见少量炎细胞浸, 润腺泡上皮变性、坏死, 间质血管充血, 呈现明显的病理性改变(图2B)。而各给药组均有不同程度的改善(高剂量图2C, 中剂量图2D, 低剂量图2E), 胰岛萎缩和胰岛细胞退行性改变的程度略有好转, 其中益气养阴活血方中剂量治疗组效果最为显著, 细胞结构趋于完整、规则, 胰岛内细胞密度及分布接近空白组。

图2 2型糖尿病大鼠实验后胰岛形态学(HE, × 400)
A.空白组; B.模型组; C.益气养阴活血方高剂量组; D.益气养阴活血方中剂量组; E.益气养阴活血方低剂量组

2.4 胰腺miRNA-375表达水平的变化

根据目的基因miRNA-375和内参U6扩增曲线显示的CT值计算miRNA-375在大鼠胰腺组织中的相对表达量, 其计算公式采用2-△ △ Ct相对定量法。结果显示:与空白组相比, 模型组miRNA-375的表达水平显著升高, 差异有统计学意义(P< 0.05, 表4)。与模型组相比, 益气养阴活血方各剂量组的miRNA-375相对表达量均有不同程度的降低(P< 0.05, 表4); 其中, 益气养阴活血方中剂量组降低miRNA-375表达水平的效果更明显, 差异有统计学意义(P< 0.05, 表5)。

表4 空白组和模型组大鼠miRNA-375相对表达量的比较( x̅± s)
表5 模型组与不同剂量组大鼠miRNA-375相对表达量比较( x̅± s)
3 讨 论

糖尿病是最常见的内分泌代谢性疾病之一, 其中90%是以胰岛β 细胞功能障碍和胰岛素抵抗(IR)为主要因素的2型糖尿病[4]。因此, 提高胰岛素分泌和降低胰岛素抵抗已成为治疗2型糖尿病的重要措施。微小RNA(microRNA, miRNA)是近些年发现的一类22~25 nt 的非编码的内源性RNA分子, 其在分子级别参与了多种疾病的发生。研究发现, miRNA对细胞的某些基因的调控, 对胰岛细胞发育、β 细胞分化及胰岛素分泌中发挥直接传递作用, 甚至在葡萄糖和脂质代谢等多方面都起一定的调控作用[5], 且2型糖尿病患者胰岛组织中miR-375异常表达, 可从胰岛素分泌、β 细胞凋亡及增殖等多个方面调控胰岛功能[6, 7, 8]。

2型糖尿病是一种复杂的代谢性疾病, 常以胰岛素抵抗和胰岛β 细胞衰竭为特征[9]。发病初期, 胰岛β 细胞分泌功能代偿性增强, 出现胰岛素抵抗和高胰岛素血症。随着病程的进展, 胰岛β 细胞分泌功能出现失代偿, 表现为胰岛β 细胞衰竭和细胞凋亡, 进一步加重糖尿病的代谢紊乱, 并导致一系列并发症。胰岛β 细胞的功能衰退是2 型糖尿病发展过程中的关键环节, 因此, 如何保护和防止胰岛β 细胞衰竭和细胞凋亡成为防治糖尿病的重点。

近年来大量研究发现中医药对保护胰岛β 细胞功能、防止细胞凋亡有积极作用, 表现出较好的发展前景。基于此, 笔者根据多年中医临床经验及用药观察, 从传统中医理论消渴病“ 从气阴两虚论治” 、“ 从瘀论治” 等观点出发, 针对该病气阴两虚兼瘀的病机采用“ 益气养阴、活血化瘀” 的治疗原则, 自拟益气养阴活血方应用于临床, 并取得一定疗效。该方以太子参、黄芪、黄精、山萸肉、葛根来益气滋阴、气阴双补, 解痉生津, 当归、丹参补血活血, 鬼箭羽、丹皮、三七粉清热凉血兼活血化瘀。诸药合用使气阴得补、瘀血得化。

大部分MicroRNA在生物体中呈特异性表达, 可调节生物体的发育、神经分化、细胞增殖、凋亡等。miR-375是在进化中高度保守的MicroRNA, miR-375在维持胰岛β 细胞结构和数量, 调节胰岛分泌功能中发挥重要作用。经过实验研究证实, 高糖环境下, miR-375呈高表达状态, 通过其靶蛋白Mtpn、Pdk1、Prkaa1、Adipor2、Insr、Jak2、Nfkb2、Pik3ca等调控相关信号通路, 使胰岛β 细胞对高血糖刺激脱敏, 导致分泌胰岛素能力下降[10, 11]。另有研究发现, miR-375可加剧棕榈酸诱导的胰岛β 细胞凋亡[12]。以上表明miR-375可作为改善胰岛β 细胞功能, 治疗2 型糖尿病的靶点。

本研究主要探讨益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰腺组织中miR-375表达水平的影响, 并分析其与胰岛β 细胞功能的相关性。整体实验结果显示, 益气养阴活血方可以降低 2型糖尿病大鼠体质量、FBG、2hPG; INS、HOMA-IR均有所降低, ISI均有所升高; 病理学检查发现益气养阴活血方可以改善胰岛结构紊乱; RT-PCR检测miR-375表达结果显示益气养阴活血方可以使糖尿病大鼠胰腺组织的miR-375表达明显下降, 提示其胰岛β 细胞功能改善作用可能与调控miR-375的表达有关。

综上所述, 益气养阴活血方能有效降低糖尿病大鼠血糖, 并改善胰岛β 细胞功能, 为中药复方制剂治疗糖尿病, 改善胰岛β 细胞功能障碍提供一定的实验基础。但是, MicroRNA在细胞功能的调节过程中会同时调控多种靶基因, 参与多个生理病理过程的调节, 或者多个MicroRNA作用于同一个基因, 甚至可能MicroRNA之间也存在着调节作用[13]。因此, 中药对胰岛β 细胞的保护作用机制也可能涉及多个靶点, 不同的信号通路之间可能也有相互作用, 值得进一步研究和探讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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