引用本文
王艳华, 王东武. 嗅鞘细胞移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用[J]. 武警医学, 2017,28(6): 591-594
WANG Yanhua, WANG Dongwu. Synergistic effect of olfactory ensheathing cells and alpha-crystallin on visual function recovery of adult rats after optic nerve injury[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2017,28(6): 591-594  

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Copyright©2017, 《武警医学》编辑部
嗅鞘细胞移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用
王艳华1, 王东武2
1.030000,爱尔眼科医院集团,太原爱尔眼科医院
2.030600 晋中,武警8650部队医院骨科

作者简介:王艳华,博士后,副主任医师。

基金资助: 基金资助:国家自然基金青年基金(31100706); 中国博士后科学基金资助(2012M521872)
摘要

目的 研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs )移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用。方法 玻璃体腔α晶体蛋白注射,联合视神经损伤近端移植OECs,分为4个实验组,包括α晶体蛋白注射组、OECs移植组、α晶体蛋白注射+OECs移植组、PBS对照组。于视神经损伤并移植OECs+玻璃体腔注射药物后即刻、1周、2周、1个月、2个月、3个月,用全自动眼电生理仪进行闪烁视觉诱发电位(flash-elicited visual-evoked potential,FVEP)检测,分析比较各时间点各组P1波的振幅及潜时。结果 OECs移植组及α晶体蛋白注射+OECs移植组FVEP的P1波振幅于视神经损伤后1周[(8.49±1.19)μv, (9.33±2.54)μv]、2周[(8.85±1.92)μv,(9.43±2.41)μv]、1个月[(8.46±1.09)μv,(8.72±1.91)μv]、2个月[(8.12±1.41)μv,(8.48±1.67)μv]、3个月[(7.68±2.56)μv,(8.08±1.47)μv],均显著高于对照组( P<0.01),二者联合组P1波振幅恢复更为明显。3个实验组FVEP的P1波潜时与对照组比较,均无统计学差异。结论 OECs移植与α晶体蛋白均明显促进视神经损伤后FVEP电生理的恢复,其中,二者联合的作用最为明显。

关键词: α晶体蛋白;; 嗅鞘细胞; 视神经损伤修复
中图分类号:R774
Synergistic effect of olfactory ensheathing cells and alpha-crystallin on visual function recovery of adult rats after optic nerve injury
WANG Yanhua1, WANG Dongwu2
1.Taiyuan Aier Eye Hospital, Taiyuan 030000, China
2.Department of Orthopaedics, Hospital 8650, the Chinese People’s Armed Police Force, Jinzhong 030600, China;
Abstract

Objective To investigate the synergistic effect of olfactory ensheating cells (OECs) and α-crystallin on visual function recovery of nerve injury in adult rats.Methods α-crystallin was injected into the vitreous cavity, and OECs were transplanted to the area of optic nerve injury. The function of optic nerves was assessed by flash-elicited visual-evoked potential(FVEP) at 1 and 2 weeks, 1 and 3 months, and immediately after OECs transplantation and α-crystallin injection.Results Compared to PBS, OECs, the combination of OECs and α-crystallin promoted the recovery of the amplitude of P1 wave at 1 week [(8.49±1.19)μv, (9.33±2.54)μv], 2 weeks [(8.85±1.92)μv,(9.43±2.41)μv],1 month [(8.46±1.09)μv,(8.72±1.91)μv], 2 months [(8.12±1.41)μv,(8.48±1.67)μv] and 3 months [(7.68±2.56)μv,(8.08±1.47)μv] after optic nerve injury (P<0.01). The recovery of the amplitude of P1 wave was much more significantin the combination of OECs and α-crystallin group than in other groups. In α-crystallin group, the amplitude of P1 wave partly recovered after 1 and 2 weeks, but decreased after 1 month, and was not significantly different from that of the PBS group after 3 months. The latency of P1 wave did not recover in OECs group, α-crystallin group, or in the combination group.Conclusions Compared to OECs and α-crystallin alone, the effect of the combination of OECs and α-crystallin on functional recovery is significant.

Keyword: α-crystallin;; olfactory ensheathing cells; visual functional recovery

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)及其伴随的嗅神经纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts, ONFs)移植, 可明显促进脊髓及视神经损伤后神经的再生[1, 2], 但是视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells, RGCs)的神经纤维离开移植的OECs/ONFs形成的“ 髓鞘样” 通道后, 难以继续再生, 更不能实现长距离再生到达视中枢[2]。玻璃体腔注射α 晶体蛋白, 也能促进视神经损伤后RGCs存活和轴突再生[3, 4, 5], 但是在视神经损伤后1个月促进再生作用基本消失[3]。笔者前期的研究发现, OECs移植联合α 晶体蛋白能更有效地促进视神经再生[6], 但对视功能的修复尚缺乏研究。本实验通过大鼠视神经损伤后FVEP检测, 研究OECs移植联合α 晶体蛋白对视神经损伤后视功能的修复作用, 进而为神经损伤和再生的基础研究提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料

成年(250~300 g)Long Evans大鼠, 雌雄不限。由第三军医大学实验动物中心提供, 符合国家医用动物使用标准, 标准号为清洁级, 检证字SCXK(渝)20020003。

1.2 细胞培养及鉴定

参照文献[7]进行OECs/ONFs培养。取成年Long Evans大鼠(体重250~300 g)断颈处死, 取出嗅球, 取嗅神经层和外颗粒层用0.125%胰酶消化15 min, 37 ℃。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化, 加入0.5%DNAse, 吸管吹打10次后, 1000 r/min, 离心5 min。弃上清, 加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液, 轻轻吹打成单细胞悬液, 接种至L-多聚赖氨酸包被的6孔培养板中, 37 ℃恒温培养箱培养。第5天首次换液, 余每3 d换液。培养第14天, 细胞密度达1.5× 106。参照文献[6, 8]分别用兔抗大鼠S-100单抗 (1∶ 200, Sigma, 美国)鉴定OECs, 小鼠抗大鼠纤维连接蛋白鉴定ONFs(1∶ 200, Santa Cruz Biotechnology, 美国)。二抗为山羊抗小鼠IgG-FITC和山羊抗兔IgG-cy3 (Boster, 中国)。

1.3 大鼠视神经钳夹伤模型制作及实验分组

参照文献[4]进行视神经夹伤及注射。每组6只, 共24只实验大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉, 固定于手术台, 手术显微镜下剪开大鼠手术眼上穹隆结膜约120° , 避开涡静脉, 钝性分离暴露视神经, 在眼球后1 mm处, 用11号尖刀沿视神经纵轴方向纵行挑开视神经鞘膜长4~5 mm, 避免损伤视神经, 用中号无创血管夹在球后2 mm处钳夹视神经10 s, 钳夹伤后即刻, 在夹伤近端, 用35 G的NF35BV-2针头垂直视神经注射OECs(浓度1× 106/ml)单细胞悬液或0.01 M的PBS, 注射量3 μ l, 注射速度要缓慢, 约40 s注完, 注射结束后, 留针2 min再拔针。术后载玻片轻压角膜, 镜下观察眼底, 无缺血者纳入实验。α 晶体蛋白(10-4 g/L, 5 μ l)或PBS(0.01 M, 5 μ l)用10μ l的微量进样器于距离视乳头约2 mm的巩膜壁上, 垂直于视神经纵轴刺入玻璃体腔。术毕分层缝合。术后大鼠术眼涂托百士眼膏, 送西南医院动物所饲养。实验分为4组:(1)OECs移植+α 晶体蛋白注射组; (2)OECs移植组; (3)α 晶体蛋白注射组; (4)PBS对照组。

1.4 FVEP电生理检测视神经功能

于视神经损伤前、视神经损伤并移植OECs+玻璃体腔注射药物后即刻、1周、2周、1个月、2个月、3个月进行FVEP检测。电生理检查参照临床视觉电生理标准[9], 大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉, 安放电极(记录电极置于枕后隆凸皮下, 参考电极置于双眼连线中点皮下, 接地电极置于鼠尾皮下), 暗适应5 min, 采用全视野刺激球白色闪光刺激, 记录FVEP。应用RETI-port 软件测量潜伏期和幅值。每组6只大鼠, 共24只大鼠。

1.5 统计学处理

应用SPSS13. 0统计软件, 计量资料以 x̅± s表示, 采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 OECs培养

培养的细胞主要由S100阳性的细胞和fibronectin阳性的细胞构成。S100阳性的细胞呈梭形, 或三角形, 称其为雪旺样细胞; 而fibronectin阳性细胞为扁平, 不规则形, 称其为星形样细胞, 两者相互交错混合生长, 无明显分界。培养2周时, 两者之间的数目比例约为1∶ 1(图1)。

图1 大鼠嗅鞘细胞培养2周形态
A.相差× 200; B. S100, fibronectin染色, S100为红色, fibronectin为绿色。标尺50 μ m

2.2 OECs与α 晶体蛋白联合对视功能修复的影响

手术前, 大鼠FVEP可见明显稳定的P1波(图2A)。视神经损伤同时进行OECs损伤局部移植及α 晶体蛋白注射后, P1波变得低平, 潜时延迟(图2B, 表1)。术后7 d、14 d, OECs、α 晶体蛋白及二者联合组P1波振幅明显恢复(P< 0.01), 而对照组无明显恢复(图2C、D, 表1)。术后1个月, 3个实验组P1波振幅较损伤14 d有所下降, 但与对照组相比仍有统计学差异(P< 0.05) (图2E, 表1)。术后3个月, 3个实验组P1波振幅进一步降低, 特别是α 晶体蛋白组P1波振幅下降更为明显, 与对照组比较, 差异无统计学意义, 但OECs组及二者联合组与对照组相比仍有统计学差异(P< 0.01) (图2F, 表1)。术后各时间点, 3个实验组P1波潜时较术前均明显延迟, 且与对照组比较, 差异均无统计学意义(P> 0.05, 表1)。

表1 大鼠视神经损伤后不同时间各组P1波振幅及潜伏期比较( x̅± s)

图2 视神经损伤同时行OECs移植、α 晶体蛋白注射术前、术后各组FVEP波形
A.术前; B.术后当天; C.术后7 d; D.术后14 d; E.术后1个月; F.术后3个月

3 讨 论

OECs是嗅觉系统中特殊的胶质细胞, 可分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性生长因子、睫状神经营养因子等多种营养因子[10], 对众多中枢神经元及RGCs具有保护和促进神经再生的作用, 为治疗脊髓和视神经的损伤提供了新的希望[2, 10, 11, 12]。虽然与脊髓损伤一样, 视神经损伤局部OECs/ONFs移植同样使胶质发生重朔, 并形成“ 髓鞘样” 通道, 保护神经再生到损伤远端, 但是与脊髓损伤所不同的是, 再生的RGCs轴突在离开OECs形成的“ 髓鞘样” 通道进入损伤远端后, 末端形成囊样膨大而不能到达靶中枢[2], 说明单纯OECs/ONFs移植存在局限性。具有热休克蛋白功能的α 晶体蛋白, 不仅能保护视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞及晶体上皮细胞的存活[13, 14]; 而且对视神经损伤后RGCs的存活也具有显著的保护作用, RGCs存活率在视神经损伤后14 d可达95%[5]。此外, α 晶体蛋白还具有明显的促进视神经再生的作用, 玻璃体腔注射α 晶体蛋白后, 再生的轴突数比注射牛血清白蛋白组显著增多, 且这一作用持续到视神经损伤后4周[3]。其机制是通过抑制轴突再生抑制物信号传导的共同作用点— — RhoA的激活, 干扰RhoA/Rock信号通路、防止生长锥的萎缩而促进轴突再生[4]。虽然α 晶体蛋白能保护RGCs存活, 并促进轴突再生, 但在视神经损伤后4周其作用明显减弱, 并且再生轴突只达到损伤区远端5 mm, 没有实现长距离再生[3], 说明单纯应用α 晶体蛋白也存在局限性。笔者最近的研究已证明, OECs移植联合α 晶体蛋白能更有效的促进视神经再生[6], 但对视功能的修复尚缺乏研究。本实验通过大鼠视神经损伤后FVEP检测, 研究OECs移植联合α 晶体蛋白对视神经损伤后视功能的修复作用。

FVEP 是视网膜受到闪光刺激后产生的视觉电生理活动, 反映RGCs至视皮层的信息传递及视皮层的电生理活动。主要以P1波的潜伏期及振幅为分析依据, 潜伏期反映视神经髓鞘功能, 视神经损伤时, 发生脱髓鞘改变, 传导速度明显减慢, 表现为潜伏期延迟。振幅主要反映视神经视网膜接受光刺激的功能, 并与靶中枢形成突触的数目有关, 视神经损伤时, 神经束内压力增高, 神经纤维水肿, 轴索传递视觉信息及运输营养因子的功能降低, 表现为振幅降低[15, 16]。通过FVEP检测视功能情况, 具有客观、无损伤、灵敏性好的特点。Sabel[17]研究结果说明, 有10%的RGCs存活, 就具备使视功能恢复的能力。Chow[18]和Galambos等[19]也证明, 2%~3%的视神经纤维与外膝体存在突触联系, 就能够具有较好的视功能。Hubel和Wiesel[20]发现, 有1%的细胞存在反应, 就能够产生一定的功能恢复。本实验结果发现, OECs移植、α 晶体蛋白玻璃体腔注射, 以及两者联合组, P1振幅于视神经损伤后7 d即有明显的恢复, OECs移植组及OECs与α 晶体蛋白联合组, P1振幅恢复情况于视神经损伤后3个月仍非常显著, 但α 晶体蛋白组于视神经损伤后2个月P1振幅较损伤1周、2周及1个月下降明显, 这可能与α 晶体蛋白单次注射, 保护RGCs存活及促进视神经再生作用持续短暂有关。与OECs移植组及α 晶体蛋白组比较, 各时间点OECs与α 晶体蛋白联合组P1振幅恢复情况均最为显著, 提示, OECs与α 晶体蛋白联合能更有效地促进损伤视神经的功能修复。本实验各实验组的P1潜伏期均无明显的恢复, 提示OECs与α 晶体蛋白不能促进视神经纤维髓鞘化, 与Li等[2]的研究结果相似, 视神经横断局部移植的OECs能伴随视神经纤维生长, 但未形成髓鞘。

本实验通过大鼠视神经损伤后FVEP检测, 证明OECs移植与α 晶体蛋白均明显促进视神经损伤后视功能的恢复, 但二者联合的作用更为明显。为神经损伤和再生的基础研究提供理论依据, 为神经损伤后再生及功能修复提供新思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Raisman G, Li Y. Repair of neural pathways by olfactory ensheathing cells[J]. Nat Rev Neurosci, 2007, 8(4): 312-319. [本文引用:1]
[2] Li Y, Sauve Y, Li D, et al. Transplanted olfactory ensheathing cells promote regeneration of cut adult rat optic nerve axons[J]. J Neurosci, 2003, 23(21): 7783-7788. [本文引用:5]
[3] Ying X, Zhang J, Wang Y, et al. Alpha-crystallin protected axons from optic nerve degeneration after crushing in rats[J]. J Mol Neurosci, 2008, 35(3): 253-258. [本文引用:4]
[4] Wang Y H, Wang D W, Wu N, et al. Alpha-crystallin promotes rat axonal regeneration through regulation of RhoA/rock/cofilin/MLC signaling pathways[J]. J Mol Neurosci, 2012, 46(1): 138-144. [本文引用:3]
[5] Munemasa Y, Kwong J M, Caprioli J, et al. The role of alphaA- and alphaB-crystallins in the survival of retinal ganglion cells after optic nerve axotomy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009, 50(8): 3869-3875. [本文引用:2]
[6] Wang Y H, Yin Z Q, Wang Y. Synergistic effect of olfactory ensheathing cells and Alpha-crystallin on restoration of adult rat optic nerve injury[J]. Neurosci Lett, 2016, 638(12): 167-174. [本文引用:2]
[7] Cao L, Su Z, Zhou Q, et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes olfactory ensheathing cells migration[J]. Glia, 2006, 54(6): 536-544. [本文引用:1]
[8] Li Y, Field P M, Raisman G. Regeneration of adult rat corticospinal axons induced by transplanted olfactory ensheathing cells[J]. J Neurosci, 1998, 18(24): 10514-10524. [本文引用:1]
[9] 李海生, 潘家普. 视觉电生理的原理与实践[M]. 北京: 科学出版社, 1999: 190-223. [本文引用:1]
[10] Kocsis J D, Lankford K L, Sasaki M, et al. Unique in vivo properties of olfactory ensheathing cells that may contribute to neural repair and protection following spinal cord injury[J]. Neurosci Lett, 2009, 456(3): 137-142. [本文引用:2]
[11] Su Z, He C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration[J]. Prog Neurobiol, 2010, 92(4): 517-532. [本文引用:1]
[12] Keyvan-Fouladi N, Raisman G, Li Y. Functional repair of the corticospinal tract by delayed transplantation of olfactory ensheathing cells in adult rats[J]. J Neurosci, 2003, 23(28): 9428-9434. [本文引用:1]
[13] Andley U P. Crystallins in the eye: function and pathology[J]. Prog Retin Eye Res, 2007, 26(1): 78-98. [本文引用:1]
[14] Mao Y W, Liu J P, Xiang H, et al. Human alphaA- and alphaB-crystallins bind to Bax and Bcl-X(S) to sequester their translocation during staurosporine-induced apoptosis[J]. Cell Death Differ, 2004, 11(5): 512-526. [本文引用:1]
[15] Maier J, Dagnelie G, Spekreijse H, et al. Principal components analysis for source localization of VEPs in man[J]. Vision Res, 1987, 27(2): 165-177. [本文引用:1]
[16] Wolin M J, Lavin P J. Spontaneous visual recovery from traumatic optic neuropathy after blunt head injury[J]. Am J Ophthalmol, 1990, 109(4): 430-435. [本文引用:1]
[17] Sabel B A. Restoration of vision I: neurobiological mechanisms of restoration and plasticity after brain damage - a review[J]. Restorat Neurol Neurosci, 1999, 15(2-3): 177-200. [本文引用:1]
[18] Chow K L. Visual discriminations after extensive ablation of optic tract and visual cortex in cats[J]. Brain Res, 1968, 9(2): 363-366. [本文引用:1]
[19] Galambos R, Norton T T, Frommer G P. Optic tract lesions sparing pattern vision in cats[J]. Exp Neurol, 1967, 18(1): 8-25. [本文引用:1]
[20] Hubel D H, Wiesel T N. The period of susceptibility to the physiological effects of unilateral eye closure in kittens[J]. J Physiol, 1970, 206(2): 419-436. [本文引用:1]