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陈文丽, 张晔, 宋瑞珍, 董友玲, 张亚娟, 高红梅. 光声光谱技术鉴别肺炎克雷伯菌的实验研究[J]. 武警医学, 2017,28(6): 617-620
CHEN Wenli, ZHANG Ye, SONG Ruizhen, DONG Youling, ZHANG Yajuan, GAO Hongmei. Application of photoacoustic spectroscopy to initial identification of Klebsiella pneumoniae[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2017,28(6): 617-620  

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光声光谱技术鉴别肺炎克雷伯菌的实验研究
陈文丽, 张晔, 宋瑞珍, 董友玲, 张亚娟, 高红梅
100039 北京,武警总医院呼吸科
通讯作者:高红梅,E-mail:gaohm777@sina.com

作者简介:陈文丽,本科学历,主治医师。

摘要

目的 探索应用光声光谱技术(photoacoustic spectroscopy,PAS)检测细菌气态挥发物(volatile compounds, VCs),作为一种无创、快速鉴定肺炎克雷伯菌的新方法。方法 利用PAS分别对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌,以及空白对照组35 ℃培养24 h后产生的VCs进行检测,获得各细菌VCs和空白组的光声光谱图,并对检测结果进行分析比较,观察肺炎克雷伯菌与空白组、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌之间VCs光声光谱图的差异。结果 同种细菌之间及空白组之间光声光谱图基本重合,表明光声光谱分析仪性能稳定,实验重复性好;肺炎克雷伯菌VCs与空白组的光声光谱图存在明显差异,同时肺炎克雷伯菌VCs在1142和1160波数附近出现了波峰,而其他三组检测细菌(鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌)均未出现。结论 应用PAS通过对肺炎克雷伯菌VCs进行检测分析,可以将肺炎克雷伯菌与鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌及铜绿假单胞菌进行区分,同时发现肺炎克雷伯菌的特征峰位于1142和1160波数段附近。

关键词: 挥发性代谢产物; 光声光谱; 肺炎克雷伯菌; 鉴定
中图分类号:R56
Application of photoacoustic spectroscopy to initial identification of Klebsiella pneumoniae
CHEN Wenli, ZHANG Ye, SONG Ruizhen, DONG Youling, ZHANG Yajuan, GAO Hongmei
Department of Respiration, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039,China
Abstract

Objective To develop a noninvasive, quick and reliable method for the identification of Klebsiella pneumonia by detecting its volatile compounds (VCs) using photoacoustic spectroscopy (PAS).Methods Photoacoustic spectroscopy trace analyzer (PASTA) was used to conduct the analysis of bacterial volatile compounds (VCs), such as the volatile metabolites of Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. The bacteria were cultured at 35 ℃ and measurement of VCs was performed after 24 hours. After that, the difference in the PAS of VCs between Klebsiella pneumonia, blank, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa was observed.Results The PAS of VCs was basically similar between the same type of bacteria or between the blank groups, indicating that the adopted PASTA was of good performance and the experiment could be easily repeated. Obvious difference in the PAS of VCs was observed between Klebsiella pneumonia and the blank groups, suggesting that new VCs were generated by Klebsiella pneumonia. Besides, the PAS of VCs showed obvious peaks of Klebsiella pneumonia at wave 1142 and 1160 while the PAS of VCs of the other three types of bacteria was smooth at these two wave numbers.Conclusions Identification of Klebsiella pneumonia could be conducted by PAS. The characteristic peak may be located at wave 1142 and 1160.

Keyword: volatile compounds; photoacoustic spectroscopy; klebsiella pneumonia; identification

肺炎克雷伯是目前国内院内感染最常见的条件致病菌之一。近年来, 由于各种有创技术的大量开展、抗菌药物的不当使用及激素和免疫抑制药的广泛应用, 肺炎克雷伯感染的发病率、耐药率及病死率逐年上升, 危害日渐严重[1, 2, 3, 4, 5]。肺炎克雷伯感染的早期病原学诊断对临床抗生素的合理选择具有重要价值。细菌鉴别的方法主要有生化法、培养法、色谱及质谱法等, 临床以培养法最为常用 [6, 7, 8, 9, 10]。这些方法各有利弊, 如生化法操作方便、简单, 但准确性差; 培养法最为可靠, 但培养需要时间较长[11]。目前, 临床中尚缺乏肺炎克雷伯菌快速、准确的鉴别技术, 从而严重制约了肺炎克雷伯菌感染性疾病的临床诊断和治疗。

本研究通过应用光声光谱分析仪对肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等4种革兰阴性菌的气态挥发物的检测, 获取4种细菌气态挥发物的光声光谱图, 并分别将肺炎克雷伯菌与其他3种菌的VCs光声光谱图进行对比分析, 获得肺炎克雷伯菌的特征峰, 旨在通过特征峰来对肺炎克雷伯菌进行识别。

1 材料与方法
1.1 检测仪器

光声光谱分析仪(型号:PASTA-10001), 由中国航天科技集团某研究所协助研制, 主要参数:气体采样容积为30 ml; 检测时间30 min; 检测精度PPb级; 在0~40 ℃的工作条件下, 其测量结果不会因环境温度和气压的变化而产生漂移。光声光谱分析仪的基本检测原理来自于气体的比尔朗伯吸收定律, 即光声池中的待测气体吸收光能量后产生脉冲压力波, 引起周围声压的变化, 并被光学微音器检测到, 其声压信号的幅度与待测气体的浓度成正比, 可利用比尔朗伯定律计算出该待测气体的浓度值[6, 7, 8, 9, 10](图1)。

图1 光声光谱技术检测原理

1.2 培养仪器

双通道玻璃气密样品取样瓶(图2)为自行设计制作, 其特征:(1)密闭, 相对不受干扰; (2)双通道, 单向气流, 便于取样。恒温恒湿培养箱(型号TH70-HWS-350, 北京中西远大科技有限公司), 控温范围:5~50 ℃, 温度波动度:± 0.5 ℃; (3)血溶培养皿(型号103, 上海微蒙生物科技有限公司), 内径103 mm, 外径108 mm。

1.3 菌种

肺炎克雷伯菌ATCC46117标准菌株、大肠埃希菌ATCC25922标准菌株、铜绿假单胞菌ATCC27853标准菌株、鲍曼不动杆菌ATCC19606标准菌株, 均由武警总医院检验科微生物室提供。

图2 玻璃气密样品取样瓶

1.4 实验方法

1.4.1 气体收集 (1)细菌组:分别挑取单菌落肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌接种在血溶培养皿上, 每种细菌各接种2个培养皿并相应地标记为肺克组1和肺克组2、铜绿组1和铜绿组2、大肠组1和大肠组2、鲍曼组1和鲍曼组2; (2)空白组:2个空白血溶培养皿, 并相应地标记为空白组1和空白组2; (3)细菌组和空白组均分别置于玻璃气密样品取样培养24 h后对瓶中的顶空气体进行取样检测, 并用止血钳夹闭密闭取样瓶两侧的橡皮管, 放于35 ℃恒温恒湿培养箱中培养24 h。

1.4.2 气体检测 (1)将培养好的取样瓶自培养箱中取出, 将其上端橡胶管直接接入光声光谱分析仪的进气口; (2)打开连接进气口的橡胶管上的止血钳, 对取样瓶中的气体真空抽气并进行检测, 获得初始实验数据(检测波数范围为1000~1250 1/cm); 重复上述方法检测其他取样瓶中的气体; (3)对各组初始实验数据用Originpro 8.5绘图软件绘出初始光声光谱图(X值表示波数 1/cm, Y值表示幅值au)。

1.4.3 光声光谱图的分析比较 (1)同一细菌组之间、同一空白组之间的光声光谱图进行比较, 判断仪器的稳定性及实验的重复性; (2)肺克组分别和空白组、鲍曼组、大肠组以及铜绿组的光声光谱图进行比较, 获取肺炎克雷伯菌的特征峰, 并通过特征峰来对肺炎克雷伯菌进行识别。

2 结 果
2.1 肺克组与空白组光声光谱比较

图3显示, 肺克组和空白组的光声光谱比较结果(部分放大图), 肺克组1和肺克组2、空白组1和肺克组2的光声光谱图形基本吻合, 表明实验中使用的光声光谱分析仪稳定性较好, 实验重复性好; 在1142、1160波数段, 肺克组出现波峰, 而对照组为较平滑的曲线, 考虑上述波数段为肺炎克雷伯杆菌特征性代谢产物出现的波数位置。

图3 肺克组和空白组35 ℃下培养24 h后光声光谱结果(部分放大)

2.2 肺克组与鲍曼组光声光谱比较

图4显示, 肺克组和鲍曼组的光声光谱比较结果(部分放大图), 可以看出, 各细菌组1和组2的图谱基本重合, 提示实验采用的光声光谱分析仪稳定性好、实验重复性好。肺克组(包括组1和组2)在1142和1160两个波数段均出现了波峰, 而鲍曼组(包括组1和组2)均为较平滑的曲线, 这与图3中显示的结果相似。

图4 肺克组和鲍曼组35 ℃下培养24 h后光声光谱结果(部分放大)

2.3 肺克组与大肠组光声光谱比较

图5显示, 肺克组和大肠组的光声光谱比较结果(部分放大图), 可以看出, 各细菌组1和组2的图谱基本重合, 提示实验采用的光声光谱分析仪稳定性好、实验重复性好。肺克组(包括组1和组2)在1142和1160两个波数段均出现了波峰, 而大肠组(包括组1和组2)均为较平滑的曲线, 这与图3、4中显示的结果相似。

图5 肺克组和大肠组35 ℃下培养24 h后光声光谱结果(部分放大)

2.4 肺克组与铜绿组光声光谱比较

图6显示, 肺克组和铜绿组的光声光谱比较结果(部分放大图), 可以看出, 各细菌组1和组2的图谱基本重合, 提示实验采用的光声光谱分析仪稳定性好、实验重复性好。肺克组(包括组1和组2)在1142和1160两个波数段均出现了波峰, 而铜绿组(包括组1和组2)均为较平滑的曲线, 这与图3、4、5中显示的结果相似。

图6 肺克组和铜绿组35 ℃下培养24 h后光声光谱结果(部分放大)

3 讨 论

传统培养皿为非密闭的装置, 在细菌培养过程中, 细菌代谢产生的微量气体易弥散于周围环境中, 而这些极低浓度的气体扩散后会明显影响检测结果。基于上述考虑, 我们自行设计了气体采集密闭取样瓶(简称取样瓶), 其主要特征为:(1)玻璃材质, 无色透明, 便于观察细菌生长情况; (2)完全密闭, 不受外界空气的干扰, 并能够浓集细菌培养24 h期间所产生的全部微量气体, 有利于检出; (3)双通道, 单向气流, 便于取样。

在微量气体检测技术上, 笔者选择的是光声光谱分析仪, 该分析仪将先进的光声光谱技术与计算机系统相结合, 是近年来兴起的一种能够对微量气体进行快速、可靠地检测的新技术。其特征:(1)红外激光光源, 波长可调节, 测量范围广, 选择性高; (2)运用先进的硅微电子机械系统 (micro electrom echanical system, MEMS)悬臂梁光学微音器, 灵敏度及精确度进一步提高; (3)体积小, 密闭金属外壳, 受外界干扰小; (4)计算机系统化, 程序可控, 操作简单; (5)与质谱、色谱及传感器法相比, 检测周期短, 仅为35 min左右, 检测步骤简洁; (6)样品前处理便捷, 样品用量少, 检测灵敏度及稳定性较高。

考虑到细菌在生长过程中易受外界环境因素的影响, 如温度、湿度、培养基及培养时间等, 有可能导致细菌产生VCs的不同, 影响实验结果。因此, 在细菌培养及检测过程中, 各实验组及对照组均尽量控制在相同条件下进行, 减少上述混杂因素的干扰, 并选择了对细菌生长较适宜的温度(35 ℃), 培养时间也选择在细菌生长代谢较活跃的时期— — 对数期(24 h), 以提高实验的稳定性及精确性。

在本实验中, 笔者检测了4种革兰阴性菌的VCs和空白组的VCs, 获得了不同细菌和空白组的VCs光声光谱图。结果发现, 同种细菌之间、空白组之间的图形基本吻合, 表明实验中使用的光声光谱分析仪稳定性好, 同种细菌产生的VCs较稳定, 且实验的重复性较好。

肺克组与鲍曼组、大肠组、铜绿组、空白组的比较发现, 肺克组在1142和1160波数附近出现波峰, 而鲍曼组、大肠组、铜绿组以及空白组均未出现。因此可根据上述特征波峰将肺克组与鲍曼组、大肠组、铜绿组、空白组进行区分。我们认为, 1142和1160可能为肺克组VCs所处的特征波数位置。在既往相关研究中, 尚未见到有关肺炎克雷伯菌VCs特征波峰的报导。2012年李绚梅等[11]曾利用固相萃取及气-质联用技术(SPME-GCMS)研究发现, 肺炎克雷伯杆菌的特征性挥发物为丁基羟基甲苯。由于本研究尚未进一步分析1142和1160波数所对应的气态成份。因此, 本研究中发现的1142和1160特征峰所代表的气态物质究竟与李绚梅等发现的丁基羟基甲苯是否存在怎样的相关性, 目前尚不清楚, 有待进一步深入研究来揭示。

目前, 检测VCs的方法主要有气相色谱法、质谱法、传感器或电子鼻法和PAS等[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]。其中, 气相色谱法与质谱法的检测模式均是需先明确目标气体, 再检测目标气体的存在与否, 即“ 逆推法” ; 传感器或电子鼻法则是先通过气味传感器进行识别, 对整体混合物的生物挥发性特征作出响应, 并以某种相似属性重新组合排列, 进而进行区别, 即“ 顺比较法” 。而光声光谱法既可以通过“ 顺比较法” , 对比不同细菌VCs的光声光谱图间的差异来区分目标菌, 又可以通过“ 逆推法” 进一步验证目标气体的存在。因此, 其灵敏度和选择性也大大提升, 这也是该方法的优点所在。

总之, 通过光声光谱技术检测肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等4种细菌VCs, 并根据其峰位和峰型的不同, 可以将肺炎克雷伯菌与其它3种革兰阴性菌(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌)进行区分, 并发现肺炎克雷伯菌的特征峰位于1142、1160波数附近。光声光谱技术检测VCs为细菌的鉴定提供了一种简单、快速的方法, 有望成为临床早期病原学检测的新技术。

The authors have declared that no competing interests exist.

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