引用本文
李剑, 闫双通, 龚燕平, 卢艳慧, 孙般若, 成晓玲, 邵迎红. 小RNA干扰沉默S100A13对甲状腺细胞侵袭、迁移的影响及机制[J]. 武警医学, 2018,29(10): 960-963
LI Jian, YAN Shuangtong, GONG Yanping, LU Yanhui, SUN Banruo, CHENG Xiaoling, SHAO Yinghong. Effect and mechanism of sliencing S100A4 by small RNA interference of S100A13 on thyroid cells[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2018,29(10): 960-963  

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小RNA干扰沉默S100A13对甲状腺细胞侵袭、迁移的影响及机制
李剑1, 闫双通1, 龚燕平1, 卢艳慧1, 孙般若1, 成晓玲1, 邵迎红2
1.100853 北京,解放军总医院,南楼内分泌科
2.100853 北京,解放军总医院,门诊部
通讯作者：邵迎红,E-mail:shaoyh021206@sina.com

作者简介:李 剑,博士,副主任医师。

收稿日期: 2018-06-01
摘要

目的 探究干扰钙结合蛋白A13(calcium binding protein A13, S100A13)基因表达对甲状腺癌TPC-1细胞侵袭、迁移的影响及可能作用机制。方法 采用小RNA干扰敲减甲状腺癌TPC-1细胞S100A13基因的表达,通过细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测S100A13对TPC-1细胞迁移能力的影响,Transwell侵袭实验检测S100A13对TPC-1细胞侵袭能力的影响,免疫印迹试验(Western Blot)检测S100A13、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、钙黏蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白的表达。结果 与对照组相比,采用小RNA干扰的人甲状腺癌TPC-1细胞划痕宽度显著升高(25.214±2.687 vs 69.223±5.291),侵袭(0.897±0.082 vs 0.521±0.053)、迁移(1.263±0.252 vs 0.759±0.062)能力显著降低( P<0.05),细胞中MMP-2(0.523±0.062 vs 0.246±0.033)、Vimentin(0.863±0.082 vs 0.458±0.053)蛋白表达显著降低( P<0.05),E-cadherin(0.445±0.053 vs 0.755±0.078)蛋白表达显著增加( P<0.05)。结论 采用小RNA干扰S100A13表达可抑制甲状腺癌TPC-1细胞的侵袭、迁移,可能与其下调上皮间质转化和MMP-2的表达有关。

关键词: 甲状腺癌; S100A13; 侵袭; 迁移
中图分类号:R736.1
Effect and mechanism of sliencing S100A4 by small RNA interference of S100A13 on thyroid cells
LI Jian1, YAN Shuangtong1, GONG Yanping1, LU Yanhui1, SUN Banruo1, CHENG Xiaoling1, SHAO Yinghong2
1.Department of Geriatric Endocrinology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China
2.Outpatient Department, PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Abstract

Objective To investigate the effect of interference with the expression of calcium binding protein A13 (S100A13) on the invasion and migration of thyroid carcinoma TPC-1 cells and the possible mechanism.Methods The expression of S100A13 gene in thyroid cancer TPC-1 cells was knocked down by siRNA. The effect of S100A13 on the migration of TPC-1 cells was evaluated with the wound healing scratch test and Transwell assay. The effect of S100A13 on the invasiveness of TPC-1 cells was assessed by Transwell invasion test. The expressions of S100A13, MMP-2, E-cadherin and vimentin were detected by Western Blot.Results Compared with the control group, the silencing of S100A13 by siRNA in human thyroid carcinoma TPC-1 cells significantly increased the scratch width(25.214±2.687 vs 69.223±5.291), but the ability of invasion(0.897±0.082 vs 0.521±0.053) and migration(1.263±0.252 vs 0.759±0.062)decreased significantly ( P<0.05). The levels of MMP-2 (0.523±0.062 vs 0.246±0.033)and vimentin(0.863±0.082 vs 0.458±0.053) in S100A13-treated cells were significantly decreased ( P<0.05), while E-cadherin protein(0.445±0.053 vs 0.755±0.078)was significantly increased ( P<0.05).Conclusions Interference with S100A13 expressions by siRNA inhibits the invasion and migration of thyroid carcinoma TPC-1 cells, which may be related to the inhibition of EMT and MMP-2.

Keyword: thyroid cancer; S100A13; invasion; migration

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一, 发病率呈逐年增加趋势[1]。甲状腺癌的侵袭、迁移是一个多阶段的复杂过程, 肿瘤细胞外基质的降解、细胞和基质间黏附力降低、细胞运动能力增强等均可影响甲状腺癌组织的转移。钙结合蛋白A13(calcium binding protein A13, S100A13)在人类多种组织中均可表达, 可通过调控细胞非经典跨膜转运通路影响细胞因子的跨膜运动, 从而参与肿瘤、炎性反应、动脉粥样硬化等疾病的发生、发展过程[2, 3]。研究表明甲状腺癌组织中S100A13的表达量上调[4]。然而, 关于S100A13在甲状腺癌细胞侵袭、迁移中的作用和机制目前并不完全清楚。本研究主要通过小干扰RNA下调S100A13基因表达, 探讨其对甲状腺癌TPC-1细胞侵袭、迁移的影响以及可能作用机制。

1 材料与方法
1.1 试剂及仪器

人甲状腺癌细胞系TPC-1购自中国科学院细胞库; RPMI-1640培养液、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司), 采用Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司), Matrigel基质胶(美国BD公司), 甘油醛-3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH )抗体、辣根过氧化物酶标记(HRP)山羊抗小鼠IgG(北京中山金桥有限公司), Transwell小室、RIPA/PMSF细胞裂解液、5× SDS Loading buffer(北京索莱宝科技有限公司), 聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)、BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光液(美国Millipore公司), 钙黏蛋白E(E-cadherin)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease, MMP-2)抗体(美国Cellular Signaling Technology公司)。

采用山东Haier公司生物安全柜, 日本Sanyo公司细胞培养箱, 倒置显微镜(德国Leica公司), 台式低速离心机、常温台式离心机(美国Thermo Fisher公司), 蛋白电泳槽(美国Bio-Rad公司), 酶联免疫检测仪(美国Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人甲状腺癌细胞系TPC-1培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液, 置于恒温37 ℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中, 每隔1 d更换1次培养液, 当细胞密度为90%时, 加入0.25%胰蛋白酶消化, 以1:2或1:3的比例进行传代。

1.2.2 细胞转染 siRNA-A13、阴性siRNA均由广州锐博有限公司合成, 转染前24 h, 以(2.5~3.0)× 105个/孔细胞接种于6孔板, 待细胞密度为80%~90%时, 将细胞分为空白对照组、阴性对照组、siRNA-A13组, 进行转染。吸取5 μ l siRNA加入250 μ l无血清培养液混合均匀, 室温静置5 min; 吸取Lipo 2000共5 μ l, 加入250 μ l无血清培养液混合均匀, 室温静置5 min; 将上述两种稀释液混匀, 室温静置15~20 min; 弃去培养液, PBS洗涤细胞3次, 加入无血清培养液, 将脂质体复合物加入6孔板细胞中, 每孔终体积是2 ml, 避光, 37 ℃、5%CO2培养箱孵育6 h, 更换为完全培养液继续培养48 h, 免疫印迹试验(Western Blot)检测转染效果。

1.2.3 细胞划痕愈合实验 收集各组细胞加入含10%胎牛血清, 将细胞密度调整为3× 105个/孔接种于6孔板中, 待细胞密度为90%, 采用200 μ l无菌枪头垂直板面划痕, 不含血清培养液洗涤刮下的细胞, 37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后, Image J软件观察细胞间距离的均值, 计算细胞划痕宽度。

1.2.4 细胞迁移能力的检测 收集各组细胞, 消化, 无血清培养液将细胞调整为(3~4)× 103个, Transwell小室置于24孔板中, Transwell小室上室中加入200 μ l细胞悬液, 下室加入600 μ l含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液, 37 ℃、5%CO2孵育24 h。取出小室, 吸去培养液, 棉签小心拭去微孔膜内残留细胞, PBS液洗涤, 甲醇固定30 min, 结晶紫染色, 400倍光镜下计数, 实验重复3次, 10%乙酸洗脱, 置于酶标仪中读取细胞的吸光值。

1.2.5 细胞侵袭能力的检测 将50 mg/L Matrigel胶加入1倍体积无血清RPMI-1640培养液稀释, 包被Transwell小室上室底膜, 37 ℃孵育60 min。实验前, 每孔细胞中加入无血清培养液, 37 ℃孵育30 min; 将Transwell小室置于24孔板中, 下室加入600 μ l含10%胎牛血清的培养液, 收集各组细胞细胞以1× 105加入上室, 37 ℃培养24 h, 棉签小心拭去残留细胞, 1%结晶紫染色15~20 min, 400倍光镜下选取10个视野计数, 实验重复3次, 10%乙酸洗脱, 置于酶标仪中读取细胞的吸光值, 取平均数。

1.2.6 Western Blot检测细胞中MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达 弃培养液, PBS液洗3次, 6孔板中每孔细胞加入80 μ l RIPA裂解液(含PMSF), 将细胞转移至离心管中, 置于冰上, 每5 min涡旋振荡1次, 充分裂解细胞, 收集细胞悬浮液, 离心, 取上清。通过稀释BCA标准品浓度, 建立标准曲线, 测定蛋白浓度。根据待测样品分子量配制分离胶, 迅速灌注于玻璃板间隙, 并注入1 ml无水乙醇进行液封。待分离胶完全聚合, 弃去无水乙醇; 制备并灌注浓缩胶, 插入梳子, 室温下垂直静置30 min, 将凝胶固定于电泳装置上。将蛋白样品与4倍体积的5× SDS Loading buffer混合, 煮沸5~10 min; 电泳缓冲液清洗凝胶样孔, 加入等量的变性蛋白, 70 V电泳1 h至蓝色条带分开, 调整电压为100~110 V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部, 停止电泳。将滤纸、PVDF膜、海绵垫浸泡于电转液中5 min, 组装转移装置, 冰浴中调整电流250 mA转膜1.5~2.5 h。将膜置于5%封闭液中, 室温孵育1.5~3 h, TBST液漂洗3次每次5~10 min, 加入一抗, 4 ℃孵育过夜, 0.1%TBST漂洗3次× 10 min, 加入二抗, 室温孵育1 h, 0.1%TBST漂洗3次× 10 min, ECL显色, Image J软件分析蛋白质灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行分析, 计量资料以 x̅± s表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间差异使用SNK-q检验, 以P< 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果
2.1 siRNA S100A13对TPC-1细胞S100A13蛋白表达的影响

Western Blot检测转染后TPC-1细胞中S100A13蛋白的表达(图1), 结果显示:siRNA-A13组S100A13蛋白的表达量(0.272± 0.023)明显低于空白对照组(0.528± 0.063), 差异具有统计学意义(P< 0.05); 空白对照组和阴性对照组细胞中S100A13蛋白的表达(0.539± 0.057)比较差异无统计学意义 。

图1 各组细胞中S100A13蛋白的表达

2.2 siRNA S100A13抑制TPC-1细胞的迁移能力

细胞划痕实验和Transwell迁移实验结果显示:siRNA-A13组细胞的划痕宽度明显高于空白对照组, 细胞的吸光值明显降低, 差异具有统计学意义(P< 0.05, 表1); 空白对照组和阴性对照组细胞的划痕宽度、吸光值差异均无统计学意义。

表1 沉默S100A13抑制TPC-1细胞的迁移能力(n=3; x̅± s)
2.3 沉默S100A13抑制TPC-1细胞的侵袭能力

Transwell侵袭实验结果显示:siRNA-A13组细胞的吸光值为(0.521± 0.053), 较空白对照组(0.897± 0.082)显著降低, 差异具有统计学意义(P< 0.05); 空白对照组和阴性对照组细胞的吸光值(0.937± 0.096), 差异无统计学意义。

2.4 沉默S100A13对TPC-1细胞MMP-2、E-cadherin和Vimentin表达的影响

Western Blot检测结果显示:siRNA-A13组MMP-2、Vimentin蛋白的表达量明显低于空白对照组(图2), E-cadherin蛋白水平显著增加, 差异具有统计学意义(P< 0.05, 表2); 空白对照组和阴性对照组细胞中S100A13蛋白的表达量差异无统计学意义。

图2 沉默S100A13对TPC-1细胞MMP-2表达、EMT的影响

表2 沉默S100A13对TPC-1细胞MMP-2、EMT的影响( x̅± s; n=3)
3 讨 论

S100蛋白家族是一类钙结合蛋白超家族, 调控钙离子与相应靶蛋白的结核作用, 从而在体内参与多种生物学反应。目前, 已被发现的S100蛋白家族成员一共21位, 且S100蛋白家族成员在多种肿瘤组织中的表达量异常, 并与肿瘤组织的浸润、远端转移相关。S100蛋白家族由2个手型结构组成, 影响钙离子与靶蛋白的结合。S100A13是S100蛋白家族的成员之一, 定位于人染色体1q21, 由98个氨基酸组成。S100A13基因在多种组织如子宫、乳腺、甲状腺、肺脏、心脏等广泛表达, 尤其在甲状腺滤泡细胞中的表达量较高[5, 6, 7]。但研究发现S100A13在前列腺、胃等组织中的表达量较低, 提示S100A13在多种组织的生理、病理过程中发挥作用[8, 9]。

本实验通过脂质体介导siRNA的方法转染TPC-1细胞, 采用Western blot实验发现siRNA-A13组细胞中S100A13蛋白较空白对照组和阴性对照组表达明显降低; 细胞划痕愈合实验和Transwell迁移实验表明沉默S100A13表达抑制TPC-1细胞的迁移能力; Transwell侵袭实验结果表明干扰S100A13表达不仅抑制细胞的迁移能力, 对其侵袭能力也发挥抑制作用。既往研究表明在肺癌细胞中, S100A13的表达量与肺癌细胞的侵袭能力密切相关[10], 与本研究结果相似。此外, S100A13在甲状腺癌组织中的表达量显著增加, siRNA 敲除S100A13基因抑制甲状腺癌TPC-1和SW579细胞的致癌性[4, 11], 表明S100A13是甲状腺癌诊断的潜在生物标志物, 但其具体的作用机制尚不清楚。

EMT在胚胎发育、肿瘤细胞的迁移、侵袭等过程中均发挥作用。在此过程中, 细胞间的黏附力降低、细胞迁移能力增强, 细胞的表型也会随之改变, 逐渐出现间质细胞的特有属性, 且细胞的侵袭、迁移能力均显著增加。肿瘤细胞发生侵袭转移的第一步是细胞发生EMT过程。Vimentin对细胞骨架的完整性发挥重要作用的中间丝蛋白, 是间质细胞的主要标志物之一, 其表达量的变化表明EMT的产生。同样, E-cadherin表达量的下降也意味着EMT的发生, 也被认为是EMT发生的重要标志物之一。有研究表明在甲状腺癌的发生、发展中, 多种基因的表达量变化对EMT过程发挥促进或抑制作用[12, 13, 14]。在上皮细胞逐渐转化为间质细胞的过程中, 细胞间连接以及黏附力丢失, 侵袭、迁移能力增强, 同时细胞外基质成分大量出现。MMP-2在细胞基底膜和细胞外基质的降解过程相关, 从而促进肿瘤细胞的运动能力、侵袭等。甲状腺癌细胞的侵袭、迁移过程与细胞外基质的降解具有密切关系[15]。本实验结果显示沉默S100A13表达抑制TPC-1细胞中Vimentin、MMP-9蛋白的表达, 促进E-cadherin蛋白的表达, 表明S100A13表达量降低可能是通过抑制Vimentin、MMP-9蛋白表达, 增加E-cadherin蛋白水平, 阻止甲状腺癌细胞外基质的降解以及EMT过程, 最终抑制TPC-1细胞侵袭、迁移。

综上所述, 本实验采用小RNA干扰S100A13表达可抑制甲状腺癌TPC-1细胞的侵袭、迁移, 可能与其下调上皮间质转化和MMP-2的表达有关。S100A13有望成为甲状腺癌诊断的潜在生物标志物, 对甲状腺癌的治疗提供新的思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

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