引用本文
张东升, 周方正, 陈洁, 郭思言, 聂龙, 李艳梅. ADAM-17抑制剂TNF484对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响[J]. 武警医学, 2018,29(7): 690-692
ZHANG Dongsheng, ZHOU Fangzheng, CHEN Jie, GUO Siyan, NIE Long, LI Yanmei. Inhibition of hepatocellular carcinoma cell proliferation, migration and invasion by a disintegrin and metalloproteinase-17 inhibitor TNF484[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2018,29(7): 690-692  
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ADAM-17抑制剂TNF484对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
张东升, 周方正, 陈洁, 郭思言, 聂龙, 李艳梅
441300,湖北医药学院附属随州医院肿瘤科
通讯作者：李艳梅,E-mail:410756836@qq.com

作者简介:张东升,硕士,主治医师。

收稿日期: 2018-02-20
基金资助: 吴阶平医学基金会临床科研专项(320.6750.17081)
摘要

目的 探讨ADAM-17抑制剂TNF484对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 选用肝癌HepG2细胞株和Bel7402细胞作为研究对象,分为TNF484抑制组及空白对照组,利用MTT法检测TNF 484对两种肝癌细胞株增殖影响,用PCR法检测TNF 484对肝癌细胞ADAM-17表达的影响,利用迁移分析及细胞侵袭实验分析TNF 484对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 TNF484可以显著抑制肿瘤细胞生长,呈剂量依赖性,100 μM 时对HepG2和Bel7402细胞株增殖抑制作用最大,抑制率分别为(80±5.6)%和(85±5.8)%;10 μM作用72 h,HepG2和BEL7402细胞株的空白对照组及抑制组的细胞分数分别为(80.92%±6.10%、55.60%±4.21%)、(82.62%±6.15%、59.8%±4.27%),两组比较差异均有统计学意义( P<0.05);同时10 μM TNF484作用 72 h后HepG2及BEL-7402细胞株中ADAM-17RNA表达水平降低,抑制率分别为(45±3.1)%及(48±3.3)%。结论 ADAM-17抑制剂TNF484对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭有明显抑制作用,ADAM-17可能是HCC基因治疗的有效靶目标。

关键词: ADAM-17; TNF484; 肝细胞癌
中图分类号:R730.2
Inhibition of hepatocellular carcinoma cell proliferation, migration and invasion by a disintegrin and metalloproteinase-17 inhibitor TNF484
ZHANG Dongsheng, ZHOU Fangzheng, CHEN Jie, GUO Siyan, NIE Long, LI Yanmei
Department of Oncology, Suizhou Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Suizhou 441300,China
Abstract

Objective To investigate the effect of ADAM-17 inhibitor TNF484 on proliferation, migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.Methods Hepatoma HepG2 cell line and Bel7402 cell line were selected as the subjects, which were divided into the TNF484 inhibition group and blank control group. MTT assay was used to detect the effect of TNF 484 on the proliferation of two hepatocellular carcinoma cell lines. PCR was used to detect the effect of TNF 484 on the expression of ADAM-17 hepatocellular carcinoma cells. The effect of TNF-484 on the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells was analyzed using migration analysis and cell invasion assays.Results TNF484 significantly inhibited the growth of tumor cells in a dose-dependent manner. The inhibition of HepG2 and Bel7402 cell proliferation reached the peak at 100 μM, and the inhibition rates were (80±5.6)% and (85±5.8)%, respectively. The cell fractions of of HepG2 and BEL 7402 cell lines in the blank control group and the inhibition group were (80.92±6.10, 55.60±4.21) and (82.62±6.15, 59.8±4.27) respectively at 10 μM for 72 h. At the same time, the expression of ADAM-17 RNA in HepG2 and BEL-7402 cell lines was decreased after ten hours of TNF 484 treatment, and the inhibition rates were(45±3.1)% and (48±3.3)%, respectively.Conclusions The ADAM-17 inhibitor TNF484 can significantly inhibit the proliferation, migration and invasion of hepatoma cells. Therefore, ADAM-17 is expected to become a new target for clinical observation and treatment.

Keyword: ADAM-17; TNF484; hepatocellular carcinoma

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见恶性肿瘤, 其恶性程度高, 临床诊断往往都已较晚, 严重威胁着人类的健康, 抑制和控制肿瘤的转移是治疗和预防癌症的主要策略[1, 2]。肿瘤的侵袭和转移是多基因、多步骤相互作用的过程。目前有研究认为细胞外基质降解酶系统:基质金属蛋白酶家族和去整合素-金属蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteases, ADAMs)参与了肿瘤侵袭及转移过程。

ADAM-17被称为α 肿瘤坏死因子转换酶(tumor necrosis factor-alpha converting enzyme, TACE), ADAM-17可以剪切脱落双调蛋白、转化生长因子等多种表皮生长因子受体的配体, 直接间接激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)相关通路来影响肿瘤细胞的发生、发展及转移[3]。许多研究表明, ADAM-17在许多肿瘤中过表达, 促进肿瘤细胞的侵袭和转移过程, 提示该基因可能在肿瘤进展中起重要作用, ADAM-17和其他ADAM蛋白酶可能是治疗癌症和其他疾病的潜在靶标[4]。由于其许多家族成员的结构复杂, 且在不同的肿瘤中表达不同, 对ADAM-17抑制剂的研究尚在早期阶段, 因此ADAM-17对肿瘤的抑制作用需要进一步研究, 这可能使ADAM-17成为新的潜在临床治疗靶点。本研究旨在探讨ADAM-17抑制剂TNF484对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法
1.1 细胞培养及抑制剂

将人肝癌HepG2细胞株和Bel7402细胞在DMEM培养液(GIBCO, USA)中培养, 10%胎牛血清(GIBCO, USA), 在37 ℃, 5%CO2和75%湿度的培养箱中, 培养液每3 d更换一次。

1.2 细胞活力检测

将1× 104 HepG2和Bel7402细胞悬浮在96孔板中的每个孔中, 加入不同浓度的抑制剂, 在37 ℃培养箱中孵育72 h, 正常细胞为阴性对照。孵育后, 每孔加入20 μ l MTT溶液(5 mg/ml), 继续培养4 h。将96孔板在4 ℃下以1200 g离心10 min, 小心吸出上清液, 然后将每孔加入50 μ l二甲基亚砜, 置摇床上低速震荡10 min。在酶联免疫检测仪490 nm吸光度下测量各孔的吸光值(OD)。测定细胞增殖及细胞活性。计算公式:抑制率IR=1-试验组的平均OD值/对照组的平均OD值。

1.3 qRT-PCR检测ADAM-17mRNA的表达

各组细胞于6孔板培养72 h后, 将不同浓度(01 μ M)的TNF484(ADAM-17抑制剂, Sigma公司)加入各组细胞培养。按Trizol试剂说明书提取细胞总RNA, 反转录成cDNA, 以GAPDH作为内参基因。RT-PCR反应条件:95 ℃, 5 min预变性后, 94 ℃, 20 s, 退火温度60 ℃, 20 s, 共40个循环, 延伸温度72 ℃ 40 s。终止反应。

1.4 迁移分析

使用xCELLigence系统(罗氏公司)检测HCC细胞的迁移能力。在CIM-16孔反应板的下室加入200 μ l(2× 104)细胞悬液, 阳性组加入TNF484, 不加TNF484作为阴性对照组。然后将10%含血清的DMEM培养液加入下室。xCELLigence系统对生长于反应孔板上的细胞阻抗进行记录。 经过72 h在RTCA分析仪上进行细胞迁移分析。

1.5 细胞侵袭实验

使用三维共培养模型(Trevigen公司)测定肝癌细胞在TNF484抑制下的侵袭能力。成球和侵袭基质成分的准备按照说明书的要求做。用DMEM和成球基质混合细胞, 在3D球培养板的每个孔中加入5× 102个细胞, 在4 ℃条件下, 200 g离心3 min。将培养板放入37 ℃孵育72 h, 让球体形成。在加入侵袭基质之前, 在4 ℃条件下, 300 g离心5 min。然后将培养板放入37 ℃, 孵育1 h, 促进侵袭胶的形成。在孔中加入10 μ M的TNF484, 每24 h记录成球的图像。用GraphPad Prism软件对图像进行分析。

1.6 统计学处理

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据处理分析, 计量资料以 x̅± s表示, 组间比较采用t检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。用GraphPad Prism软件对图像进行分析。

2 结 果
2.1 TNF484抑制剂对肝癌细胞增殖能力的影响

随着抑制剂浓度增加, 抑制率也增高, TNF484在100 μ M 时对HepG2和BEL7402细胞增殖抑制作用最大(表1)。

表1 不同浓度TNF484抑制剂对肝癌细胞株(HepG2、BEL-7402)增殖的抑制率( x̅± s; %)
2.2 TNF484抑制剂对肝癌细胞迁移能力的影响

TNF484孵育细胞72 h, 10 μ M浓度条件下, 即可显著抑制细胞的迁移, HepG2细胞的空白对照组及抑制组的细胞分数分别为80.92%± 6.10%、55.60%± 4.21%, BEL7402细胞的空白对照组及抑制组的细胞分数分别为82.62%± 6.15%、59.8%± 4.27%, 两组之间细胞分数比较, 差异均有统计学意义(P< 0.05)。

2.3 TNF484抑制剂对肝癌细胞系中ADAM-17表达水平的影响

10 μ M TNF484在处理72 h后HepG2及BEL-7402细胞株中ADAM17 RNA表达水平降低, 抑制率分别为(45.0± 3.1)%及(48.0± 3.3)%, 与处理前比较, 差异均有统计学意义(P< 0.05)。

2.4 TNF484抑制剂对肝癌细胞侵袭能力的影响

与空白组相比, 10 μ M的TNF484显著降低了HepG2及BEL-7402细胞的侵袭能力(图1), 阳性对照组第1天细胞的迁移能力分别为空白对照组的(35.7± 3.1)%、(39.7± 3.5)%, 第15天细胞的迁移能力分别为空白组的(30.7± 2.1)%、(31.2± 2.6)%(P< 0.05)。

图1 TNF484抑制剂对肝癌细胞株侵袭能力的影响
A.HepG2; B. BEL-7402

3 讨 论

肿瘤的侵袭及转移是多基因、多步骤相互作用的过程, 主要包括恶性肿瘤细胞从原发灶迁移黏附到细胞外基质(extracellular matrix, ECM)、降解并穿过ECM和基膜、通过血管进入宿主微环境等步骤。肝癌广泛转移是其造成高病死率的主要原因, 因此找到一种能够抑制肝癌侵袭转移的药物, 是有效治疗肝癌的关键。

目前的研究认为, ADAM-17在肿瘤的转移和侵袭中起重要作用[5]。ADAM-l7是ADAMs 家族成员之一, 属于含锌蛋白酶, 具有水解细胞膜上的肿瘤坏死因子的功能[6]。与大多数的ADAMs成员类似, ADAM-17具有多个功能结构域[7], 在N端, 存在保守的氨基酸序列, 称之为半胱氨酸开关, 与催化区的Zn2+结合, 使ADAM-17处于酶原状态。ADAM-17可以剪切脱落双调蛋白、转化生长因子等多种表皮生长因子受体的配体, 直接或间接激活EGFR相关通道。通过激活PI3K/AKT、Ras/Raf/MAPK等多条信号转导途径影响肿瘤细胞基因表达、细胞的增殖分化和侵袭[8, 9]。近年来多项研究表明, ADAM-17 在非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结直肠癌和胰腺癌等多种肿瘤组织中高表达, 并促进肿瘤的侵袭转移过程[10, 11, 12], ADAM-17可能成为肝癌特异性治疗的潜在靶点。

目前EGFR、VEGF等靶向治疗药物已取得满意的临床疗效, ADAM-17 抑制药的研究还在起步阶段, 需进一步明确其抑制肿瘤作用[3, 13]。TNF484是以琥珀酸为基础的氧肟酸, 有很强的TACE抑制性[4]。当前TNF484在肝癌细胞株中的研究较少, 本研究发现TNF484对肝癌细胞株增殖能力有明显的抑制作用且呈剂量依赖性, 且在迁移和侵袭也有着显著的抑制作用。本实验中, TNF484在10 μ M浓度条件下, HepG2和BEL7402细胞株的空白对照组及阳性组即有显著的统计学意义, 同时也发现TNF484可以显著降低癌细胞中ADAM-17的表达, 与文献[14]报道一致。因此, 推论TNF484可能通过降低ADAM-17在HCC中的表达来抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及转移, 进而抑制HCC的发展。TNF484对肝癌动物模型中肿瘤的生长和侵袭的抑制作用, 需要进一步检测。

总之, ADAM-17抑制剂TNF484抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

The authors have declared that no competing interests exist.

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