引用本文
荆翠翠, 张英, 周茉, 刘媛媛, 张红英. 高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑皮质线粒体生物合成的影响[J]. 武警医学, 2018,29(8): 786-789
JING Cuicui, ZHANG Ying, ZHOU Muo, LIU Yuanyuan, ZHANG Hongying. Hyperbaric oxygenation promotes mitochondrial biogenesis in cerebral cortex of neonatal rats after hypoxic ischemic brain damage[J]. Medical Journal of the Chinese People's Armed Police Forces, 2018,29(8): 786-789  
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高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑皮质线粒体生物合成的影响
荆翠翠1, 张英1, 周茉1, 刘媛媛1, 张红英2
1.100049 北京,清华大学玉泉医院儿科
2.100039 北京,武警总医院质量管理科
通讯作者：张红英,E-mail:wknh930@sina.com

作者简介:荆翠翠,硕士,主治医师。

收稿日期: 2018-02-12
摘要

目的 观察高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑皮质线粒体生物合成的影响及其相关信号通路。方法 新生7日龄Wistar大鼠48只随机分为假手术组(Sham,16只),HIBD模型组(HIBD,16只)和高压氧治疗HIBD组(HBO+HIBD,16只)。结扎左侧颈总动脉后暴露于92% 氮气和8%氧气缺氧环境中2 h 制备HIBD 模型。HIBD +HBO 组在缺氧缺血后给予高压氧干预,每次持续90 min,每日1次,连续7 d。末次高压氧干预后24 h,每组动物随机抽取8只处死,检测脑皮质COXⅣ、PGC-1α、Tfam和NRF1表达。剩余动物饲养至40日龄进行Morris水迷宫检测。结果 HBO+HIBD组与HIBD组比较,逃避潜伏期显著缩短[(21.49 ±3.77)s vs (42.50±6.46)s, P<0.01],穿越平台次数、COXⅣ、PGC-1α、Tfam和NRF1表达均显著升高[分别为(7.41±1.13)次 vs (5.26±0.78)次,(82.15±14.84)kPa vs (62.83±11.02)kPa,(112.19±18.41)kPa vs (67.26±10.40)kPa,(92.15±13.99)kPa vs (76.40±9.32)kPa和(72.29±12.88)kPa vs (49.28±7.14)kPa, P<0.050.01]。结论 高压氧可通过上调PGC-1过-NRF1/Tfam通路促进脑皮质线粒体生物合成,从而改善大鼠HIBD后空间学习记忆能力。

关键词: 高压氧; 新生大鼠; 缺氧缺血性脑损伤; PGC-1脑; 线粒体生物合成
中图分类号:R651.15
Hyperbaric oxygenation promotes mitochondrial biogenesis in cerebral cortex of neonatal rats after hypoxic ischemic brain damage
JING Cuicui1, ZHANG Ying1, ZHOU Muo1, LIU Yuanyuan1, ZHANG Hongying2
1.Department of Pediatrics, Yuquan Hospital of TsinghuaUniversity; Beijing 100049, China
2.Department of Quality Management, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039, China
Abstract

Objective To observe the effect of hyperbaric oxygenation on mitochondrial biogenesis and related signal pathways in the cerebral cortex of neonatal rats after hypoxic ischemic brain damage.Methods Forty-eight 7-day postnatal Wistar rats were randomly divided into 3 groups: sham operation group (Sham, n=16), hypoxic-ischemic brain damage group (HIBD, n=16) and hyperbaric oxygenation treated group (HBO+HIBD, n=16). An HIBD model was established via ligation of the right common carotid artery followed by hypoxia exposure (8%O2+92%N2) for two hours. In HBO+HIBD group, rats received hyperbaric oxygenation (90 min a day, for 7 consecutive days) after HIBD.Eight rats in each group were sacrificed at 24 h after HBO, and the cerebral cortex was used to detect the expressions of COXⅣ, PGC-1α, Tfam and NRF1. Other rats were tested with Morris water maze at 40 days old.Results As compared with HIBD group, the escape latency in HBO+HIBD group was obviously shorter(21.49±3.77 vs 42.50±6.46, P<0.01). The number of times of crossing the platform and the expressions of COXⅣ, PGC-1α, Tfam, and NRF1 were significantly increased (7.41±1.13 vs 5.26±0.78, 82.15±14.84 vs 62.83±11.02, 112.19±18.41 vs 67.26±10.40, 92.15±13.99 vs 76.40±9.32, and 72.29±12.88 vs 49.28±7.14, respectively, P<0.050.01).Conclusions Hyperbaric oxygenation can ameliorate spatial learning and memory impairment in neonatal rats after HIBD. The protective mechanism of HBO may be related to the promotion of PGC-1a-NRF1/Tfam mediated mitochondrial biogenesis in the cerebral cortex.

Keyword: hyperbaric oxygenation; neonatal rats; hypoxic ischemic brain damage; PGC-1; mitochondrial biogenesis

新生儿围生期因窒息导致缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage, HIBD), 可引起智力发育迟缓、癫痫、脑瘫等一系列严重的神经系统功能障碍疾病, 甚或死亡[1]。高压氧(hyperbaric oxygenation)指在高于大气压的环境中吸纯氧的一种治疗方法, 因其能快速提高循环系统氧分压, 常用于缺血缺氧疾病的治疗[2]。高压氧对新生儿HIBD的干预机制尚不清楚, 因而其在临床应用尚存争议。

中枢神经系统高度依赖线粒体氧化磷酸化产能, 因而线粒体成为脑组织缺血缺氧主要受累细胞器。研究表明, 缺血缺氧导致线粒体呼吸链电子传递过程中电子漏增加, 大量氧自由基产生超过了抗氧化酶清除能力, 导致线粒体功能受损[3]。张小燕等[4]证明, 高压氧可改善新生大鼠缺血缺氧后脑皮质细胞线粒体膜电位。值得注意的是, 细胞能量水平由线粒体质量和数量共同决定, 后者受到线粒体生物合成(mitochondrial biogenesis)的调控, 是线粒体质量控制的关键环节[5]。本研究拟观察高压氧是否可通过改善线粒体生物合成提高新生大鼠大脑皮质对缺氧缺血的抵抗力, 并探讨相关机制。

1 材料与方法
1.1 材料

新生7日龄健康雄性Wistar大鼠48只, 体重11~18 g, 由北京维通利华实验动物技术公司提供。随机分为三组, 假手术组(Sham), HIBD模型组(HIBD)和高压氧治疗HIBD组(HBO+HIBD), 每组16只。

1.2 HIBD模型制备

HIBD和HBO+HIBD两组动物参照文献制备HIBD模型。大鼠乙醚麻醉, 仰卧位固定, 颈部正中线切开, 游离左侧颈总动脉, 双线结扎后在中间剪断, 关闭切口。术后1 h将大鼠放入37 ℃恒温缺氧密闭箱, 箱内持续通氮氧混合气体(92% 氮气和8%氧气)。缺氧2 h后取出, 由母鼠喂养, 直至21日龄。Sham组大鼠不结扎和剪断左侧颈总动脉, 其余操作同HIBD模型。

1.3 高压氧治疗

HBO+HIBD组动物在HIBD建模后30 min放入高压氧舱(氧浓度85%90%, 压力为2个标准大气压)内吸氧90 min。每隔24 h入舱治疗一次, 连续治疗7次。HBO治疗后24 h, 每组动物随机抽取8只, 断头处死, 冰面上快速分离双侧脑皮质, 冻存于-80 ℃用于Western检测。剩余大鼠继续饲养至40日龄, 进行Morris水迷宫检测。

1.4 Morris水迷宫行为学检测

水迷宫的圆形水池分为东、西、南、北四个象限。加入牛奶使池水浑浊, 透明平台放置于水面下2 cm。实验全程水温恒定为23 ℃, 水池周边物体位置保持不变。(1)定位航行试验, 共5 d, 每日分为上午和下午两个训练时间段, 每个时间段4轮次, 分别从4个象限的中点面壁入水, 如大鼠在60 s内找到并爬上平台, 则将时间记录为其逃避潜伏期, 如大鼠在60 s内未能找到平台, 其逃避潜伏期为60 s。每次训练间隔60 s。(2)空间探索实验, 第6天撤除水池中平台, 原平台对侧象限中心为大鼠入水点, 观察120 s内穿越原平台所在位置的次数, 定义为穿越平台次数。所有大鼠入水点必须一致。

1.5 大脑皮质相关蛋白表达

Western blot法检测, 以β -tubulin为内参。大脑皮质组织匀浆与SDS上样缓冲液混合加热处理5 min, 上样后经SDS-PAGE电泳分离, 湿转法转移至PVDF膜, 对应一抗振荡孵育12 h, PBS洗净后用辣根过氧化物酶标记二抗静置孵育1 h, PBS洗净后用显色试剂盒显影, X-ray胶片曝光记录。扫描条带灰度值。Sham组条带灰度值定义为100%, HIBD和HBO+HIBD组为与Sham组比较的相对表达量。

1.6 统计学处理

计量数据表示为 x̅± s, 使用SPSS 15.0统计软件中单因素方差分析进行组间比较, P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 实验动物数量分析

在HIBD模型制备期间, 假手术组大鼠无死亡, HIBD模型组死亡3只, 高压氧治疗HIBD组死亡2只。高压氧治疗期间大鼠无死亡。最终进行Western blot蛋白检测的, 三组大鼠均为8只。进行神经行为学检测的, 假手术组8只, HIBD模型组5只, 高压氧治疗HIBD组6只。

2.2 高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠神经行为学的影响

与Sham组比较, HIBD和HBO+HIBD组逃避潜伏期均显著延长(P< 0.05), HIBD组穿越平台次数显著减少(P< 0.01)。HBO+HIBD与HIBD组比较, 逃避潜伏期显著缩短(P< 0.05), 穿越平台次数显著增多(P< 0.01)。见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的变化( x̅± s)
2.3 高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠大脑皮质线粒体生物合成相关蛋白表达的影响

与Sham组比较, HIBD和HBO+HIBD组COXⅣ 和NRF1表达均显著降低(P< 0.05), HIBD组PGC-1α 和Tfam表达显著降低(P< 0.01)。HBO+HIBD与HIBD组比较, COXⅣ 、Tfam、NRF1和PGC-1α 表达均显著升高(P< 0.05)。见表2, 图1。

表2 各组大鼠大脑皮质线粒体生物合成相关蛋白表达的变化( x̅± s; %)

图1 各组大鼠大脑皮质COXⅣ 、PGC-1α 、Tfam和NRF1表达
注:Sham代表假手术组, HIBD代表HIBD模型组, HBO+HIBD代表高压氧治疗HIBD组。

3 讨 论

线粒体生物合成是在细胞核DNA和线粒体DNA两个基因组协同调控下, 形成新生线粒体的过程。细胞应对内、外环境改变时, 通过线粒体生物合成调控线粒体数量, 从而实现能量代谢持续性重构, 提高细胞适应能力。此外, 应激导致线粒体损伤, 线粒体生物合成启动以发挥修复和补充的功能[6]。本研究中, 新生大鼠HIBD后, Morris水迷宫测试结果显示, 其空间学习记忆能力明显障碍, 同时脑皮质线粒体生物合成异常, 表现为线粒体数量标志蛋白COXIV表达水平降低。Demarest等[7]在新生大鼠HIBD后脑皮质中发现, 反映单个线粒体健康水平的线粒体膜电位显著降低。结合本研究结果, 提示缺血缺氧通过抑制线粒体生物合成降低线粒体修复和新生能力, 进一步加重神经元能量供应障碍。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活因子1(PGC-1α )是调控线粒体生物合成的关键转录因子。PGC-1因可通过促进核呼吸因子NRF1表达启动细胞核DNA编码的线粒体组件蛋白表达, 亦可通过促进线粒体转录因子A(Tfam)表达启动线粒体DNA编码的线粒体组件蛋白表达[8]。本研究中, 新生大鼠HIBD后脑皮质PGC-1α 、NRF1和Tfam表达均明显降低。Sosunov等[9]发现, 缺血初期海马组织PGC-1α 代偿性升高, 而持续性缺血导致PGC-1α 表达降低。研究表明, 炎性反应因子主控基因NFκ B可直接结合PGC-1α 启动子, 抑制后者表达[10]。Gu等[11]发现, 新生大鼠HIBD后脑皮质NFκ B表达异常升高。以上提示, 缺血缺氧诱导NFκ B对PGC-1α 的抑制可能是新生大鼠HIBD后脑皮质线粒体生物合成障碍的机制之一。

本研究发现, 高压氧显著改善新生大鼠HIBD后空间学习记忆能力, 同时部分恢复COXIV表达水平。Choi等[12]报道, 线粒体营养素α -硫辛酸可提高大鼠脑缺血后空间学习记忆能力, 同时增加脑皮质线粒体体密度。这提示上调线粒体生物合成是高压氧提高新生大鼠脑皮质抵抗HIBD能力的途径之一。 笔者还发现, 高压氧提高了HIBD后脑皮质PGC-1α 及其下游NRF1和Tfam的表达水平。Susilo等[13]证明, 高压氧显著抑制创伤深部骨骼肌NFκ B表达及活性。这可能是高压氧逆转HIBD对PGC-1α 表达抑制的通路之一。研究表明, PGC-1α 不仅参与调控线粒体生物合成, 还参与调控MnSOD、GPx等线粒体抗氧化酶的表达[14]。Zhu等[15]证明, 高压氧可明显抑制HIBD后脑组织氧化应激水平。笔者推测, 在高压氧干预HIBD中, PGC-1α 上调不仅与改善线粒体生物合成相关, 还可能与提高神经元抗氧化能力相关。

总之, 本研究证明高压氧可通过上调PGC-1α -NRF1/Tfam通路上调脑皮质线粒体生物合成, 这可能是高压氧改善大鼠HIBD后空间学习记忆能力的神经保护机制之一。

The authors have declared that no competing interests exist.

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